单一延长应激对Wistar大鼠海马Calcineurin表达的影响

姜 淼，王越甲，安秋霖，杨济菲，马欣桐，李思慧，谢菊华

创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder，PTSD)是经历或目睹严重威胁生命安全的创伤事件后出现的精神疾病[1,2]。这些创伤事件主要包括战争、地震海啸等自然灾害、性暴力等，同时严重躯体疾病如过敏性休克、截肢、尿毒症、致死性恶性肿瘤等也可导致PTSD[3]，据报道约有9.6%的乳腺癌患者可发展为PTSD，并严重影响患者的治疗及康复[4]。但至今为止，PTSD发病机制尚不清楚。Calcineurin(CaN)是大脑内广泛存在的、由催化亚基A(CaN A)和调节亚基B(CaN B)构成的四聚体蛋白磷酸酶[5]，参与了许多疾病如阿尔茨海默病、抑郁等的发生发展，在恐惧消退、神经元结构和兴奋性调节上发挥了重要作用[6,7]。本研究拟采用单一延长应激暴露建立PTSD动物模型，以观察CaN在PTSD致海马损伤中的表达改变，为PTSD发病机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康成年雄性Wistar大鼠(n=30)，体重180～210 g，由辽宁省长生生物有限公司提供。将大鼠随机分为正常对照组(Control组，n=15)、单一延长暴露组(SPS组，n=15)。适应性喂养7 d后SPS组大鼠给予如下[8,9]应激暴露：禁锢大鼠2 h；强迫游泳20 min；休息15 min后乙醚麻醉1～3 min致深度昏迷。随后分笼常规饲养至14 d后取材进行后续试验。

1.2 方 法

1.2.1 ELISA检测海马组织CaN 水平 各组大鼠冰上快速剥离海马后，剪碎匀浆，1000 g/min离心取上清。依据ELISA试剂盒(购自上海酶联生物有限公司)说明书进行后续操作，具体步骤如下：(1)标准品、待测样品各取50 μl加入96孔板孔隙内;(2)各孔内加入生物素标记的抗体(各50 μl)，震荡混匀后37 ℃孵育1.5 h;(3)甩去反应孔内液体，加入洗涤液，震荡30 s，甩去洗涤液，用滤纸拍干。重复操作3次;(4)每孔加入亲和链酶素-HRP，37 ℃孵育30 min;(5)按上述洗板后，加入50 μl终止液;(6)立即450 nm波长处测定各反应孔OD值，并换算出待测样品浓度。

1.2.2 Western blot检测CaN蛋白表达 取材时剥离海马组织，根据海马重量按100 g∶0.3 ml加入RIPA 裂解液，超声粉碎后12000 r/min、4 ℃离心后取上清。依据BCA蛋白定量试剂盒(购自北京鼎国)说明书检测蛋白浓度。各组分别取50 μg样品蛋白于8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳恒压200 mA转膜1 h，5%牛胚血清常温封闭1.5 h，随后加入一抗4 ℃过夜(CaN Aα：ABclonal公司，1∶500稀释；GAPDH：北京中杉金桥公司，1∶1000稀释)。TBST洗膜10 min×3次后加入HRP标记的二抗肠胃孵育1.5 h。再次TBST洗膜10 min×3次后ECL发光显影。对获得的条带经Image J软件分析，对各组灰度值CaN Aα/GAPDH的比值进行数据分析。

1.2.3 免疫组化检测CaN蛋白分布 采用0.4%戊巴比妥钠对两组大鼠进行腹腔麻醉。麻醉成功后暴露心脏,剪开右心耳，用生理盐水灌流，直至流出液无色；随后用4%组织固定液灌流至大鼠肝脏发硬。取大鼠脑组织，并浸泡至固定液中6 h后采取石蜡包埋、切片待用。切片常规脱蜡水化后用30%H2O2(1份)+蒸馏水(10份)去除内源性过氧化物酶，随后5%BSA封闭0.5 h后直接滴加一抗CaN Aα(ABclonal公司，1∶100)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后加入二抗，室温孵育0.5 h后滴加DAB显色液，光学显微镜下观察CaN Aα在不同海马分区的分布并用Image J软件分析CaN Aα阳性细胞所占百分比，并进行数据统计。

2 结 果

2.1 ELISA检测结果 SPS组海马组织匀浆中CaN水平低于健康对照组(t=2.77，P<0.05)，提示单一延长应激后大鼠海马CaN水平降低(见图1)。

2.2 Western blot 检测结果 CaN Aα蛋白在正常脑组织表达较多，尤其是海马组织[6]。单一延长应激后大鼠海马CaN Aα的表达明显降低，与正常对照组比较有显著差异(t=8.88，P<0.01)(见图2)。

2.3 免疫组化结果分析 CaN Aα蛋白在正常大鼠和单一延长应激暴露大鼠海马不同区域的分布。CaN Aα免疫组化阳性产物为棕黄色颗粒，单一延长应激后大鼠海马CA1、CA3神经元棕黄色颗粒所占面积明显减少(CA1区两组比较，t=3.766，P<0.05；CA3区两组比较，t=5.42，P<0.01)，提示SPS暴露抑制了大鼠海马CA1、CA3区CaN Aα的表达，而齿状回(DG)区两组无明显差异(t=0.823，P>0.05)(见图3)。

注：Control代表正常对照组，SPS代表单一延长应激组，单一延长应激组CaN水平明显降低(P<0.05)

图1 ELISA方法检测单一延长应激组与正常对照组海马匀浆CaN的水平比较

注：Control代表正常对照组，SPS代表单一延长应激组，单一延长应激组CaN Aα 蛋白表达明显下调(P<0.05)

图2 两组海马CaN Aα 蛋白表达对比

注：Control代表正常对照组，SPS代表单一延长应激组，单一延长应激组海马CA1区CaN Aα 蛋白表达明显降低(P<0.05);CA3区CaN Aα蛋白也明显降低(P<0.01)

图3 两组CaN Aα蛋白在不同海马区域的比较

3 讨 论

PTSD多见于严重创伤事件后，患者常常表现出现噩梦、高度警惕、持续回避、选择性遗忘等临床症状[1,2]。既往PTSD归属于焦虑障碍性疾病，但2013年第5版《American Psychiatric Association:Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders》(DSM-5)提出“负性情绪和认知改变”也是其常见的临床症状之一，并将其从焦虑障碍中分离出来，归属于创伤和应激相关障碍性疾病。2018年WTO第11版《International Classification of Diseases》支持并延续了PTSD的分类，PTSD的临床诊断标准进一步得到细化和明确，慢性负性情绪与认知改变逐渐被重视和研究。

海马是机体情绪管理、学习认知、记忆等的重要调控结构[10]。长期负性情绪改变可使海马神经元可塑性降低、学习记忆能力降低、认知功能衰退和加速脑老化进程。而对海马体积缩小的PTSD患者给予认知行为治疗，患者海马体积可达到与对照组无明显差异[11]。由此可见，海马损伤是PTSD发生发展的关键，本研究以海马为主要研究结构，以探讨PTSD的具体发病分子机制。

CaN是大脑内广泛存在的一种蛋白磷酸酶，参与了恐惧、抑郁、痴呆等许多疾病的发生发展，在神经元兴奋性、突触可塑性、记忆形成、情绪调控等上发挥了重要调控作用[5～7]。CaN抑制剂是临床上器官移植患者常见的预防和治疗排斥反应的药物，但长期使用可诱导患者出现抑郁样行为，如早期给予CaN抑制剂治疗的肾移植患者中，高达66%的患者出现抑郁[12]。同时动物模型实验结果发现，大脑杏仁核CaN下调是诱导焦虑和抑郁行为的充分条件[13]，CaN是海马恐惧记忆的负性调节因子[14]。这些研究提示CaN功能抑制是引起抑郁情绪的重要机制。

在本研究中，我们观察发现单一延长应激暴露后大鼠海马组织匀浆CaN水平明显低于对照组(P<0.05)。而Western blot检测结果也表明PTSD模型大鼠海马CaN Aα蛋白表达显著低于健康对照组(P<0.01)，同时CaN Aα蛋白在海马CA1、CA3区表达显著减少(P<0.01)，而齿状回区(DG)无明显变化(P>0.05)。这些研究结果提示我们单一延长应激可致大脑海马CaN下调。鉴于CaN在抑郁、焦虑等负性情绪与恐惧记忆上的重要作用，我们有理由怀疑CaN下调与PTSD抑郁、焦虑、记忆力降低、认知减退有关，该方面尚待进一步深入研究。总之，本研究结果表明单一延长应激可下调大鼠海马CaN表达，CaN抑制可能是PTSD海马损伤的重要分子机制之一。