辅酶Q10对人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

邓莹莹，丁慰祖

(上海市第八人民医院眼科，上海 200235)

辅酶Q10，又名泛醌，是一种类维生素作用物质，脂溶性分子，为抗氧化作用非常强的抗氧化剂。辅酶Q10是线粒体呼吸链的重要组成部分，是广泛存在于生物体内的各类细胞中的一种化合物，在体内发挥着非常重要的作用[1]。研究[2-3]表明，辅酶Q10具有抗氧化作用，能回收利用维生素E，清除体内自由基；增强机体的体液和细胞免疫；对体内的肿瘤细胞具有一定的杀伤作用；且能够明显缓解机体疲劳，提高运动机能；对心脑血管疾病有预防和治疗作用。近年来，研究[4-5]还发现辅酶Q10对老年人的视网膜疾病的治疗有一定的疗效。青光眼、年龄相关性黄斑变性等多种眼科疾病的发生与多种因素有关，包括视网膜衰老、眼压升高、营养、遗传、环境、机械性损伤、氧化损伤等，而其中的氧化损伤在老年人眼科疾病的发生中占有非常重要的作用，因而越来越受人们的关注。然而，辅酶Q10对视网膜上皮细胞的作用效果是否为直接作用，以及其可能的作用机制等问题并未得到全面揭示，这些问题的深入研究将有望为此类疾病的诊疗提供思路。本研究采用人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)作为研究对象，采用辅酶Q10进行干预，使用药物梯度实验明确Q10对RPE是否具有保护性作用，并采用分子免疫学等技术从细胞氧化应激损伤、凋亡等角度分析辅酶Q10的可能作用机制，为辅酶Q10对老年人眼科疾病的预防与治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞处理

人视网膜色素上皮细胞株RPE-19(购自中山大学眼科中心)置于37 ℃培养箱(5% CO2)中，用含10%小牛血清的DMEM培养液中进行培养。实验分为4组，氧化应激模型组，细胞在200 μmol/L的H2O2溶液中培养2 h；试验组分为两组，10 μmol/L辅酶Q10组、1 μmol/L辅酶Q10组，两组细胞分别经10 μmol/L、1 μmol/L辅酶Q10培养48 h后，继续在200 μmol/L的H2O2溶液中培养2 h；正常对照组细胞，不加辅酶Q10和H2O2处理。

1.2 细胞活性检测

细胞活性检测采用CCK-8法进行，在4组细胞中加入10%CCK-8工作液，同时设立对照组，然后置于培养箱中孵育30 min，在450 nm波长下利用酶标仪测定每孔的OD值，每组设6复孔，实验重复3次。

1.3 细胞内活性氧检测

细胞内活性氧采用DCFH-DA荧光探针检测法进行，4组细胞用DCFH-DA活性氧荧光检测试剂盒(购自苏州碧云天生物公司)检测ROS表达量，实验重复3次。

1.4 细胞中 Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的检测

采用Western blot法检测细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表达，提取经过不同处理的4组细胞蛋白质，应用BCA法测定蛋白浓度。将各组蛋白样品进行电泳分离，同时加入蛋白Marker，进行软膜，脱脂奶粉封闭，顺序加入一抗、二抗，曝光，胶片扫描，用Image J 软件对条带进行灰度分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞RPE-19活性的影响

H2O2处理后的细胞的活性明显下降，且均低于正常对照组(P<0.05)。经辅酶Q10预处理的细胞，其细胞活性明显高于单纯用H2O2处理的模型组细胞，1 μmol/L辅酶Q10组和10 μmol/L辅酶Q10组与氧化应激模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞RPE-19活性的影响

*P<0.05，与正常对照组比较；#P<0.05，与氧化应激模型组比较。

2.2 辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞RPE-19活性氧的影响

H2O2处理后的细胞内活性氧的含量明显增高，且高于正常对照组(P<0.05)。经辅酶Q10预处理的细胞，其细胞内活性氧的水平明显低于单纯用H2O2处理的模型组细胞内活性氧水平，1 μmol/L辅酶Q10组和10 μmol/L辅酶Q10组与氧化应激模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞RPE-19活性氧的影响

*P<0.05，与正常对照组比较；#P<0.05，与氧化应激模型组比较。

2.3 辅酶Q10对人视网膜色素上皮细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表达影响

辅酶Q10能够抑制H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞中Caspase-3、Bax的表达，促进可以抑制凋亡的Bcl-2的表达，H2O2可以使细胞中的Caspase-3、Bax的表达量升高，且抑制Bcl-2的表达。与氧化应激模型组比较，1 μmol/L辅酶Q10组和10 μmol/L辅酶Q10组细胞中Caspase-3、Bax的表达量低于氧化应激模型组，Bcl-2的表达量高于氧化应激模型组。H2O2还可诱导Akt的磷酸化，1 μmol/L辅酶Q10组和10 μmol/L辅酶Q10组的磷酸化-Akt的表达量低于氧化应激模型组。见图1。

3 讨论

伴随着社会老龄化的加剧，老年性眼病呈现高发的趋势，与年龄相关性黄斑变性、青光眼、白内障等多种眼病均引起严重的视力障碍，严重者会导致患者永久失明[6-8]。而引起这些眼部疾病的最重要的一个因素就是氧化应激，如果能够预防和治疗氧化应激，对于控制这些眼部疾病的发生和治疗均具有非常重要的意义。

辅酶Q10是生物体内的一种抗氧化剂物质，天然存在于机体内，已在临床上广泛地应用于许多疾病的预防和治疗[9-11]。辅酶Q10在体内各种组织和器官中的含量随着年龄的增长而降低，因此其生理作用能力相应的下降，与多种慢性疾病的发生均有关系。通过外源补充辅酶Q10可以提高其在体内的水平，有助于其在体内发挥抗氧化作用，预防一些慢性疾病的发生[12-13]。

关于辅酶Q10在眼部疾病发生、发展中的作用研究较少，本研究应用辅酶Q10预处理人视网膜色素上皮细胞，然后用H2O2诱导氧化损伤，探讨辅酶Q10对人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究。结果表明，辅酶Q10能够增强H2O2处理后的视网膜色素上皮细胞的活性；降低由于H2O2引起的细胞内活性氧的水平。临床上多种眼科疾病与视网膜上皮细胞氧化应激密切相关，如老年性白内障、糖尿病视网膜病变等，辅酶Q10抗上皮氧化作用提示具有潜在的临床应用价值。同时，本研究显示辅酶Q10具有抑制人视网膜色素上皮细胞中Caspase-3、Bax的表达，促进细胞中Bcl-2的表达水平的作用。辅酶Q10体外干预具有抑制视网膜上皮凋亡的效果，这可能是其疗效机制之一。而Akt是调控凋亡的重要信号，辅酶Q10干预显著抑制了人视网膜色素上皮细胞中Akt的磷酸化水平，提示辅酶Q的可能作用机制为抑制Akt信号。

综上，本研究采用体外研究的方法，证实了辅酶Q10对人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用机制。这可能是通过细胞发生氧化损伤，抑制与凋亡发生相关因子的表达(如caspase-3、Bax等)，促进凋亡抑制因子Bcl-2表达，抑制Akt发生磷酸化等多个方面起作用。