衰老的II型肺细胞与电离辐射诱导的放射性肺炎小鼠持续性肺纤维化的相关性研究

谭化，季辉，李娜，张秀敬，贾营

(1.石家庄市第三医院干部保健科，河北 石家庄 050051；2.沧州中西医结合医院肺病科，河北 沧州 061000)

肺纤维化是一种进行性肺病，其特征在于功能性肺泡上皮细胞的严重损伤和细胞外基质蛋白的过量产生[1]。随着与纤维化相关的分子事件的研究进展，出现了许多新的治疗方法，其涉及细胞因子，生长因子和生化信号传导途径[2]。但目前还没有有效的治疗方法来逆转或延缓这种疾病的进程[3]。肺纤维化的发病机制仍然难以捉摸。然而，II型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cells，AEC II)的氧化应激、增生、剥脱和凋亡可能是这种情况下的重要早期特征[4-6]。越来越多的证据表明氧化应激参与肺纤维化的发病机制。本研究对电离辐射诱导的小鼠进行AEC II衰老细胞测定，发现接受射线诱变、诱变时间可以增加衰老细胞的含量。易受氧化应激影响的AEC II细胞产生并分泌表面活性蛋白、肺泡上皮细胞功能的标志物，以便保持肺组织的形态组织、生物物理功能、生化组成和免疫功能[7]。细胞衰老是一种稳定的细胞周期停滞的条件，涉及多种生理过程，包括胚胎发育、肿瘤抑制、组织修复和有机体衰老[8]。由慢性和重复性微损伤引起的上皮缺损被认为是IPF患者严重纤维化的关键机制[9]。肌纤维母细胞的激活、迁移和侵袭，及细胞外基质的沉积，被提议作为这种自我维持和潜在的炎症非依赖性疾病的后续结果[10]。本研究发现局灶性上皮破坏和AEC II凋亡的发生被是持续性肺纤维化的关键标志，其中还原性辅酶II是重要的中介物质。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验大鼠 使用10周龄的雌性C57Bl / 6NCr小鼠，根据要求将实验小鼠置于饲养笼中喂养并观察小鼠的健康状况，保证能自由摄取食物和水，环境温度23 ℃ 恒温，空气湿度50%，交替12 h给予光照条件。饲养至实验处理期间没有出现小鼠死亡显现，有3只小鼠精神比较萎靡，剔除实验过程。

1.1.2 小鼠及原代培养肺细胞电离辐射诱导放射性肺炎模型 将10周龄的雌性C57BL/ 6NCr小鼠限制用于胸腔照射，铅屏蔽身体的其余部分。用X-RAD 320以2.61Gy /min的2.0-mm Al过滤(300 kV峰)递送辐射。根据实验要求对不同组的小鼠给予不同剂量的射线处理，分别为0 Gy，5 Gy，17.5 Gy，持续15周。同时，对小鼠的原代培养肺细胞进行不同剂量的射线处理。在磷酸盐缓冲盐水或载体中用二苯基碘鎓1 mg/kg处理单独的一组小鼠(6只)，在照射后立即通过皮下注射递送(17.5 Gy)，每周5 d，持续16周。

1.1.3 实验分组 根据实验需求，将实验小鼠随机分为3组：对照组(每次射线剂量为0 Gy，n=6)；5 Gy组(每次射线剂量为5 Gy，n=6)；17.5 Gy(每次射线剂量为17.5 Gy，n=6)；根据不同剂量的射线，将小鼠原代培养肺细胞分为原代细胞对照组、5 Gy+原代细胞组、17.5 Gy+原代细胞组、17.5 Gy+DPI+原代细胞组。在第3周和10周麻醉处死小鼠，解剖后将充气的肺组织包埋在最佳切割温度化合物，福尔马林固定和石蜡包埋，然后快速冷冻并储存在-80℃直至使用。

1.1.4 医学伦理学问题 所有实验程序均经动物保护和使用委员会批准，并根据实验动物护理和使用指南进行实验。

1.2 实验方法

1.2.1 TUNEL测定AEC II细胞凋亡情况 根据制造商的方案进行TUNEL测定(原位凋亡检测试剂盒；瑞士巴塞尔霍夫曼拉罗什有限公司)。使用辣根过氧化物酶介导的二氨基联苯胺反应显现TUNEL阳性信号。细胞核用苏木精溶液复染。将整个幻灯片划分为9个区域，并选择5个区域，包括每个角落和中心区域，以测量细胞凋亡指数。然后以400倍的放大率拍摄每个视野。包含非实质结构的区域，如大型气道或血管，被丢弃。对于每个显微照片，手动计数总肺泡间隔细胞的数量和测试为TUNEL阳性的肺泡隔膜细胞的数量。计算每个图像的阳性肺泡隔膜细胞相对于肺泡隔膜细胞总数的百分比，并获得每只小鼠的平均值。在每只小鼠的5个20×场上计数衰老，DHE阳性或TUNEL阳性细胞的数量，并表示为总AEC II的百分比。具有褐色染色细胞核的细胞被认为是凋亡细胞。

1.2.2 定量实时PCR分析 通过实时聚合酶链反应检查肺组织中相关基因表达。收集实验组中小鼠切除肺并使用TRIzol匀浆，并根据制造商的方案分离总RNA。用oligo dT和Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(赛默飞世尔科技)在42 ℃逆转录RNA 45 min。根据制造商的方案，使用Platinum Taq DNA聚合酶(赛默飞世尔科技)，用引物扩增cDNA。聚合酶链反应产物在含有溴化乙锭的1.20%琼脂糖凝胶中电泳，并用紫外发光器(Kodak)数字显色。 使用计算机软件(Quantity One)对带强度进行半定量。

1.2.3 Western Blotting 使用购自Cell Signaling Technology(CST#9662，丹麦丹佛斯，美国)的抗体通过蛋白质印迹分析检测肺组织中β-gal表达。在不同剂量的射线处理后，收集右上肺叶样品并在组织裂解物中匀浆。通过BCA方法测定每个样品中的总蛋白质含量。通过SDS-PAGE分离细胞溶质级分，转移并固定在硝酸纤维素膜上。通过在室温下与PBS中的5%脱脂奶粉一起温育2 h来封闭膜，与抗蛋白酶-3一起温育。然后，将膜在含有吐温20(PBST)的PBS中洗涤3次。在室温下使用抗兔辣根过氧化物酶二抗(1∶15 000；中国上海阿布玛)2 h，用ECL化学发光系统检测免疫复合物。将来自光密度测定法的β-gal水平标准化为GAPDH水平。

1.2.4 组织染色和胶原蛋白测定 通过Masson三色技术(西格玛奥德里奇)评估纤维化，对于免疫组织化学(在补充方法中描述，在线获得)，对去石蜡切片进行抗原修复，阻断和一抗孵育。针对前表面活性剂C，p21和NOX4的抗体获自艾博抗贸易有限公司，针对8-OHdG的抗体获自Genox。通过ImmPRESS / ImmPACT组织化学(加利福尼亚州伯林盖姆矢量实验室)使用核快速红染色显现免疫反应性。

1.2.5 β-gal活性检测 用市售测定法评估衰老相关的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性。将冷冻切片与10 μM二氢乙锭(DHE；纽约格兰德岛生命科技公司)在光保护的加湿室中于37 ℃温育30 min。

2 结果

2.1 各组实验小鼠中AEC II细胞凋亡率比较

TUNEL染色并对在对电离辐射处理的第3周、10周小鼠进行AECII细胞凋亡率的测定，结果发现17.5 Gy组、5 Gy组较对照组AECII细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。第3周时，17.5 Gy组的AECII细胞凋亡率与同期的对照组相比更高，差异有统计学意义(P<0.01)。对3组小鼠辐射诱导肺纤维化比较，5 Gy组、17.5 Gy组较对照组肺组织的纤维化程度加重(P<0.05)。见图1及表1。

表1 AEC II细胞凋亡率比较

2.2 小鼠肺组织中相关炎症因子mRNA表达情况

通过实时PCR扩增，对不同方法处理的3周和10周小鼠进行TNF-α、Caspase-3的mRNA表达情况，结果发现与对照组相比，5 Gy组、17.5 Gy组TNF-α、Caspase-3的mRNA表达上升，细胞炎症凋亡情况加重，差异有统计学意义(P<0.05)。与5 Gy组相比，17.5 Gy组中TNF-α、Caspase-3的mRNA表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2及表2。

表2 小鼠肺组织炎症因子mRNA表达情况

2.3 各组实验小鼠中衰老AEC II细胞含量

对各实验组小鼠的肺组织进行AEC II衰老细胞检测，结果发现，对照组与5 Gy组在AEC II衰老细胞方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。而17.5 Gy组较5 Gy组和对照组，AEC II衰老细胞含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明加大辐射剂量和延长辐射时间可以加大小鼠肺组织中AEC II衰老细胞的含量。见表3。

表3 AEC II衰老细胞含量

2.4 实验第5周肺组织β-gal蛋白表达情况

蛋白印记分析小鼠组织中β-gal蛋白表达，第5周对3组实验小鼠进行β-gal进行蛋白质印记分析测定，结果发现17.5 Gy组较5 Gy组、5 Gy组含量相对升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 小鼠β-半乳糖苷酶含量测定

2.5 小鼠原代肺细胞中DHE氧化情况测定

在小鼠原代肺细胞培养的第5天，在不同条件的处理基础上对各组细胞进行二氢乙锭(DHE)氧化性检测，同时细胞进行β-gal活性染色。结果发现，17.5 Gy+原代细胞组与5 Gy+原代细胞组、原代细胞对照组相比，细胞DHE染色率及β-gal染色率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；17.5 Gy+原代细胞组与17.5 Gy+DPI+原代细胞组相比，细胞DHE染色率及β-gal染色率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 AEC II衰老细胞含量

2.6 小鼠原代培养细胞纤维细胞增殖及及胶原蛋白含量

在小鼠原代肺细胞培养的第5天，在不同条件的处理基础上对各组细胞进行二氢乙锭(DHE)氧化性检测，同时细胞进行β-gal活性染色。结果发现，17.5 Gy+原代细胞组与5 Gy+原代细胞组、原代细胞对照组相比，细胞DHE染色率及β-gal染色率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；17.5 Gy+原代细胞组与17.5 Gy+DPI+原代细胞组相比，细胞DHE染色率及β-gal染色率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各原代培养细胞中纤维细胞增殖及胶原蛋白含量

3 讨论

目前，辐射诱发肺纤维化的病因仍存在争议，但已报道肺细胞损伤是其他病因纤维化的主要因素。有研究[11-12]假设AEC II凋亡消失是无效肺泡修复的主要原因，导致上皮应激和纤维增生；但实际上，AEC II的靶向消耗导致快速进行性纤维化。相反，辐射后肺细胞有丝分裂原的递送在晚期时间点恢复上皮完整性并减少纤维化。据研究[13]报道，辐射后细胞凋亡会导致肺细胞丢失。本研究在非纤维化和纤维化辐射后观察到相当的AEC II凋亡，表明单独的AEC II凋亡不足以引起纤维化。此外，在暴露于5 Gy后观察到AEC II计数的逐渐恢复，但在暴露于纤维化剂量后未观察到。这表明再生能力可能是剂量敏感的，并且与急性细胞毒性无关。在特发性肺纤维化患者的肺部和博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中观察到上皮细胞衰老。支持肺细胞复制潜力在肺纤维化中的重要性，端粒酶逆转录酶TER和端粒酶的RNA组分TERC的突变已被确定为遗传性特发性肺纤维化的原因[14-15]。本研究假设AEC II耗竭是由衰老引起的干细胞功能丧失引起的，在纤维化辐射后观察到AEC II衰老和氧化应激的时间和剂量依赖性增加。这些发现与AEC II作为肺泡干细胞的作用一致，因此复制的潜能丧失容易导致AEC II消耗并导致肺纤维化[16-19]。实际上，衰老程度而非细胞凋亡与AEC II耗竭的严重程度相关。

衰老的细胞在照射后的正常组织损伤中具有重要作用[20-21]。使用通过细胞毒性处理增强衰老的试剂可能无意中增强辐射毒性。已知活性氧物质诱导细胞衰老并在肺损伤和纤维化的实验模型中升高。超氧化物是由还原性辅酶II同种型产生的潜在的有毒的活性氧物质。在博来霉素暴露后，还原性辅酶II4与上皮细胞凋亡有关，并且已被描述为辐射肺中氧化应激和细胞凋亡的来源。本研究发现抑制还原性辅酶II足以阻止AEC II衰老。衰老的肺细胞刺激成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌，这种作用被还原性辅酶II抑制阻断。这些发现表明，衰老的肺细胞通过还原性辅酶II直接刺激纤维化。虽然这些数据强烈表明衰老在辐射诱发肺纤维化中起作用，并且氧化应激是该过程的关键，但本研究存在局限性。虽然这些数据表明辐射诱发肺纤维化衰老的作用，但定义致病作用将需要评估衰老衰老小鼠对纤维化的抵抗力。本研究使用的动物模型被广泛用于辐射诱发肺纤维化的研究，但评估人体组织中的衰老对于理解该过程在人体辐射损伤中的重要性以及确定这些数据是否适用于患者都是至关重要的。研究患者的衰老和辐射损伤具有挑战性，并受到受伤部位缺乏冷冻组织的限制。冷冻组织的收集是验证这些发现的重中之重。最后，应该指出本研究并未评估衰老在其他经历辐射损伤的器官中的重要性。

综上，本研究将AEC II衰老鉴定为辐射诱发肺纤维化和还原型辅酶II作为治疗靶标的新机制。最重要的是，这些研究数据表明晚期辐射损伤可能是由于慢性氧化应激导致组织“老化”和加速干细胞衰老，这一发现可能对接受放射治疗的患者产生重要影响。