硼酸钠对人肝癌HepG2细胞Hedgehog信号通路蛋白表达的影响

陈羊，武伦，魏英，周文波，陈琴华，袁方均

(1 锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地,湖北十堰442000；2 湖北医药学院附属东风医院；3 武当特色中药研究湖北省重点实验室)

我国是肝癌高发地区，每年约36.9万人死于肝癌, 约占全球肝癌死亡总数的47.2%[1]。目前针对肝癌的治疗手段有限，总体治疗效果并不理想，急需探索新型有效的治疗方法。流行病学研究发现，硼的摄入量与肺癌、前列腺癌、乳腺癌的发病率呈负相关。因此，硼在肿瘤治疗方面具有重要的研究价值。本课题组前期研究发现，硼酸钠可抑制人肝癌HepG2细胞的生长活性，但具体作用机制并不清楚。研究发现，Hedgehog信号通路与肝癌细胞增殖密切相关。2018年6月～2019年2月，我们观察了硼酸钠对人肝癌HepG2细胞Hedgehog信号通路中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表达的影响，初步探讨硼酸钠抑制HepG2细胞增殖与Hedgehog信号通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂、仪器 硼酸钠(天津博迪化工股份有限公司)；人肝癌细胞株HepG2(武汉大学典型培养物保藏中心)，DMEM高糖培养液、胰蛋白酶(Gibco公司)，10%胎牛血清(天杭生物科技有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(Qiagen公司)，PCR引物由上海生工生物有限公司设计并合成；兔抗人Gli2抗体、兔抗人Ptch1抗体、兔抗人Cyclin D1抗体、鼠抗人β-Tubulin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(GeneTex公司) ，BCA蛋白浓度定量测定试剂盒(碧云天公司)；CO2培养箱(Thermo公司)，IX71倒置相差荧光显微镜(Olympus公司)，荧光定量PCR仪(RotorGene公司)，电泳仪和半干转膜仪(Hoefer Inc公司)，UPV INC凝胶成像系统(Gene公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组处理 将HepG2细胞从液氮中取出并解冻，在37 ℃、5% CO2条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养液中恒温培养，每48 h换液1次。待细胞融合度达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞并传代培养。取处于对数生长期状态好的细胞，以1×105/孔接种于细胞6孔板中，随机分为实验组和对照组。实验组用含4.0 mmol/L硼酸钠培养基处理，对照组不处理，两组均用不含胎牛血清的DMEM培养基培养24 h。

1.2.2 HepG2细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA检测 采用qRT-PCR法。取各组细胞于1.5 mL EP管中，采用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA，具体步骤同试剂盒说明书。利用紫外分光光度仪测定RNA的OD260/OD280值，确保比值在1.8～2.0，应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA；以GAPDH为内参，按荧光定量试剂盒说明步骤建立PCR反应体系。反应体系：2×SYBR Mix 10 μL,10×cDNA模板1 μL,上下游引物各0.5 μL。引物序列：Ptch1上游5′-CAGAGAAGGCTTGTGGCCAC-3′、下游5′-GCTCAATGACTTCCACCTTCG-3′，Gli2上游5′-TGGCCGCTTCAGATGACAGATGTTG-3′，下游5′-CGTTAGCCGAATGTCAGCCGTGAAG-3′，Cyclin D1上游5′-CCATGGAACACCAGCTCCTG-3′，下游5′-CGGTCCAGGTAGTTCATGGC-3′；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。实验重复3次，以目的基因域循环数(Ct)值对同一样本的内参照基因GAPDH Ct值进行目的基因表达的相对定量分析。

1.2.3 HepG2细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞于1.5 mL EP管中，在4 ℃高速离心机中以1 500 r/min离心5 min；弃除培养液并保留细胞沉淀，用预冷PBS洗3次；加入细胞裂解混合液(细胞裂解液1 000 μL、磷酸酶抑制剂10 μL、蛋白酶抑制剂 1 μL、PMSF 10 μL)，置于4 ℃摇床剧烈震荡30 s，放置冰上裂解30 min。在4 ℃高速离心机中以12 000 r/min离心5 min，取上清全蛋白提取物，用BCA蛋白定量试剂盒测定各组样本蛋白浓度。变性后取30 μg总蛋白，用10%分离胶进行SDS-PAGE电泳(浓缩胶45 V、分离胶55 V，4 h)。电泳完毕后，将蛋白用半干转膜仪电转至PVDF膜；根据Marker剪下相应区域的PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭，室温摇床孵育2 h；分别加用TBST稀释1∶1 000的一抗，4 ℃冰箱孵育过夜；用TBST溶液充分洗涤PVDF膜3次，每次10 min。分别将PVDF膜置于1∶10 000稀释的二抗封闭夜中，室温摇床下孵育1 h；用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min。将PVDF膜在滤纸上控干后，用ECL显色试剂盒显色；在UPVINC凝胶成像系统显影，扫描胶片并用Image J软件测量各条带灰度值。以β-Tubulin为内参，以目的蛋白与内参灰度比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA表达比较 与对照组比较，实验组细胞中Hedgehog信号通路Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。见表1。

表1 两组细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表达比较 与对照组比较，实验组细胞中Hedgehog信号通路Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。见表2、图1。

表2 两组细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

图1 HepG2细胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表达情况(Western blotting法)

3 讨论

Hedgehog信号通路在正常胚胎和干细胞的发育中起着关键作用，而肿瘤的形成与该通路异常激活密切相关。大量实验研究表明，Hedgehog信号在肝癌、基底细胞癌、髓母细胞瘤、白血病、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌中激活[2]。有学者通过建立一种转基因小鼠模型观察Hedgehog表达与肝纤维化及肿瘤发生发展的关系，最终发现Hedgehog通路在肝脏中的表达引起肝纤维化，同时激活肝星状细胞和成纤维基因，促进癌基因表达而诱发肝癌发生[3,4]。Hedgehog信号通路由配体(hh)、跨膜蛋白受体(Ptch1)、跨膜蛋白(Smo)及转录因子(Gli1、Gli2、Gli3)等组成。当前研究认为，Gli1是转录激活因子，Gli3是转录抑制因子，而Gli2是主要的调节转录激活物。当细胞膜上的Ptch1与hh配体结合时，Hedgehog通路启动，从而激活Gli2转录因子，继而调控靶基因Gli1、Bcl-2、c-Flip、Cyclin D1、c-myc及VEGF的表达，触发肿瘤细胞增殖等。在细胞周期增殖过程中，Cyclin D1能加快细胞由G1期转化到S期，使细胞周期加快，引起细胞过度增殖。典型的Hedgehog信号通过诱导Cyclin D1和c-myc基因在细胞增殖中起重要作用[5]，因此该通路被认为是肝癌治疗的重要靶点。在肝癌细胞株及肝癌组织中,Hedgehog信号通路相关因子均高表达[6]。Yu等[7]发现，在接受5-氟尿嘧啶化疗的胃癌患者中，Gli2高表达与癌症复发的风险增加有关；下调Gli2表达后使胃癌细胞对化疗药物更加敏感，进而抑制胃癌细胞增殖。在调控靶基因表达和肝癌细胞增殖方面，Gli2在肝癌细胞增殖中起主导作用，下调Gli2表达后可明显抑制肿瘤细胞增殖，表明抑制Gli2表达为肝癌的治疗提供了新途径[8]。

硼是人体一种重要的微量元素，在体内主要以硼酸盐的形式发挥功能，参与人体生长发育、能量利用、骨质代谢、免疫调节等过程，具有特殊的生理作用。有文献报道，硼的化合物可作为多种蛋白酶抑制剂，可发挥抗凝血、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、调节激素等作用[9]。以硼酸为结构的选择性肽类化合物，作为蛋白酶抑制剂，对60种人肿瘤细胞株生长具有抑制作用[10]。在一项大鼠肝癌细胞实验中发现，硼能够部分逆转肝细胞损伤，减少氧化应激及自由基的产生，进而负向调节肝癌细胞的分裂增殖[11]。在肿瘤治疗方面，硼中子俘获治疗以其精准靶向、低毒高效的优势成为新型放射治疗方法，已经成功治愈了脑胶质瘤、复发性头颈部肿瘤、黑色素瘤等疾病[12]。氮化硼纳米球可以将抗癌药物有效地输送到肿瘤细胞中，从而使其成为治疗癌症的潜在靶向纳米载体[13]。五水五硼酸二钠对人前列腺癌细胞株DU145的生长具有明显抑制作用，其可能是通过干扰肌动蛋白聚合的动态特性和降低端粒酶活性而发挥其细胞生长抑制作用[14]。p53是重要的肿瘤抑制基因，硼酸钠可以活化HepG2细胞p53基因的表达，激活并上调Bax基因表达水平，抑制Bcl-2基因表达，从而启动线粒体依赖的凋亡途径，诱导HepG2细胞凋亡[15]。另一项研究发现，硼酸钠作用于HepG2细胞后通过上调促凋亡蛋白CHOP的表达并活化内质网应激蛋白Grp78，从而诱导细胞发生凋亡[16]。

结合课题组前期研究成果，我们发现硼酸钠对HepG2细胞生长活性具有明显抑制作用，Hedgehog信号通路与肝癌细胞增殖密切相关。为了进一步研究硼酸钠抑制HepG2细胞生长机制与Hedgehog信号通路之间的关系，我们检测了HepG2细胞中Hedgehog信号通路中相关因子的表达情况。结果发现，实验组细胞中Hedgehog信号通路关键因子Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表达量较对照组降低。这表明硼酸钠作用于HepG2细胞后可明显抑制Hedgehog信号通路表达，该通路中主要转录激活物Gli2因子表达明显降低，通路下游细胞周期蛋白Cyclin D1表达下降，从而抑制了肿瘤细胞周期中由G1期到S期的转化过程，并最终抑制肿瘤细胞增殖。通过本次研究，我们认识到硼酸钠可通过下调Hedgehog信号通路的表达进而抑制HepG2细胞增殖，这进一步表明硼酸钠在细胞信号传导中具有抗肿瘤的效应，为新型抗肿瘤药物的研发及作用靶点提供了有利支撑。