富氢液对化疗所致小鼠认知功能障碍的影响及机制

胡南，赵洪伟，张霄蓓，王捷夫

(1天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床研究中心，天津300060；2 天津市肿瘤防治重点实验室；3 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心)

化疗是肿瘤治疗最常用的方法之一，接受化疗的患者中约有1/3会发生化疗所致认知功能障碍(CICI)[1]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床常用化疗药物之一，且被证实与CICI的发生相关[2]。认知功能障碍的发生与巨噬细胞的极化有关[3]，巨噬细胞根据其表型可以分为经典活化型巨噬细胞(M1型)和替代活化型巨噬细胞(M2型)，Notch通路可促进巨噬细胞由M2向M1型转化；M1型极化能引起促炎因子IL-6、IL-1β持续释放，M2型可通过上调IL-10表达抑制炎症反应[4]。研究表明，长期饮用富氢液(HRS)具有认知保护作用[5]。Sirtuin-1是一种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，可通过抗炎、抗氧化应激、稳定代谢和染色体等作用对病理状态下的中枢神经系统进行保护，可作为临床治疗中枢神经系统疾病的新靶点[6]。2018年1～9月，我们观察了富氢液对5-FU所致小鼠认知功能障碍的影响，并探讨Sirtuin-1在其中的作用，为阐明富氢液治疗CICI的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂、仪器 健康雄性CD1小鼠270只，8周龄，体质量20～30 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验获医院动物保护和应用委员会批准。2%富氢液：利用GCH300高纯度氢气发生器产生氢气，采用氢电极法检测富氢液所含氢气浓度；探针型分子氢监测仪(美国Unisense A/S公司)，蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)，台式离心机(美国Thermo Electron Corpo ration公司)，条件恐惧箱和Y迷宫(XR-XY1032，上海欣软信息科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与化疗处理 采用随机数字法将小鼠分为对照组(C组)、富氢液组(HRS组)、5-FU组、5-FU+富氢液组(5-FU+HRS组)和5-FU+富氢液+Sirtuin-1抑制剂Nicotinamide组(5-FU+HRS+Nico组)5组各54只。HRS组和5-FU+HRS组、5-FU+HRS+Nico组采用2%富氢液腹腔注射(5 mL/kg，连续注射14 d)，5-FU+HRS+Nico组予富氢液后即行Nicotinamide腹腔注射(30 mg/kg,连续注射14 d)，5-FU组、5-FU+HRS组和5-FU+HRS+Nico组采用5-FU腹腔注射(20 mg/kg，连续注射14 d)。

1.2.2 认知功能观察

1.2.2.1 恐惧事件认知能力观察 采用条件恐惧实验。每组取小鼠15只，放于恐惧箱内适应120 s。给予声音(20 s，70 dB)作为条件性刺激(CS)，间隔时间25 s；给予足部电击(2 s，0.7 mA)作为非条件性刺激(US)，电击停止后间歇60 s。然后进入下一轮，共重复6次。每组分别于药物处理全部结束后24 h，应用视频监测分析系统(Any maze系统分析软件)记录并分析僵直时间。将动物置于相同的场景环境(训练期的恐惧箱)中，不给予CS和US，记录5 min内的僵直时间，以此评价其对恐惧事件认知能力。

1.2.2.2 空间识别记忆能力观察 采用Y迷宫空间探索实验。将Y迷宫随机分为新异臂(N臂)、起始臂(S臂)和其他臂(O臂)，N臂内壁贴上不同图形以区别于其余两臂。每组取小鼠15只，实验包括训练期和测试期两个阶段。训练期：挡住N臂，大鼠由S臂放入，在S和O臂自由活动10 min，跳出迷宫者淘汰，训练结束后放回饲养笼。间隔20 min后，开始检测期，打开N臂，由相同S臂放入，在3个臂中自由活动5 min；每组分别于药物处理全部结束后24 h，采用Any-maze视频软件追踪分析系统记录5 min内大鼠在N臂的停留时间，用以评价大鼠的空间识别记忆能力。

1.2.3 海马组织中巨噬细胞分型 采用免疫荧光染色法。每组分别于药物处理全部结束后24 h取小鼠8只，采用脊椎脱臼法处死后取脑组织；分别采用CD11b和CD206标记M1型与M2型巨噬细胞，采用Iba-1标记巨噬细胞。制备新鲜冰冻切片，晾干(5～10 min)；使用4%多聚甲醛固定30 min，由PBS洗脱(5 min×3次)；采用 0.3% Triton破膜30 min，采用PBS洗脱(5 min×3次)；加入解冻BSA或羊血清在37 ℃条件下封闭30 min，再利用5% BSA或羊血清(PBS稀释)室温封闭1 h；加入一抗(1∶200)，4 ℃过夜；PBS洗脱后采用二抗(FITC或TRITC，1∶1 000)37 ℃避光1 h，PBS洗脱(5 min×3次)；盖玻片封片，荧光显微镜下观察。每只动物选取3张脑片，每张脑片选取3个视野观察海马CA1区；采用Image J图像分析系统计算阳性蛋白面积，取均值表示目的蛋白表达。以CD11b或CD206/Iba-1×100%，表示M1型与M2型巨噬细胞。

1.2.4 海马组织中IL-1β、IL-6、IL-10检测 采用ELISA法。每组分别于药物处理全部结束后24 h取小鼠8只，采用脊椎脱臼法处死后取脑组织；采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10，按照ELISA试剂盒(索莱宝公司)说明书操作。

1.2.5 海马组织中Sirtuin-1、细胞内Notch受体结构域(NICD)总蛋白和核蛋白检测 采用Western blotting法。于药物处理全部结束后24 h，每组取小鼠8只；采用脊椎脱臼法处死后取脑组织，其中双侧海马一侧提取总蛋白、一侧提取核蛋白。海马称重，加入RIPA缓冲液冰上充分匀浆；4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，即为组织总蛋白；提取核蛋白采用超声约20 s，4 ℃下以13 000 r/min离心15 min,小心吸取上清液，即为组织核蛋白。SDS-PAGE电泳60 min，转膜1 h；加入兔抗鼠多克隆抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次；加入羊抗兔二抗，室温孵育1 h，ECL显影。应用Image J图像分析软件分析目的条带的灰度值，以目的条带的灰度值/同一标本的内参灰度值表示靶蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间比较 与C组比较，5-FU组、5-FU+HRS组和5-FU+HRS+Nico组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间缩短(P均<0.05)，HRS组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)；与5-FU组比较，5-FU+HRS组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间延长(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组5 min内的僵直时间、N臂停留时间比较

注：与C组比较，*P<0.05；与5-FU组比较，#P<0.05。

2.2 各组小鼠海马组织中巨噬细胞分型变化 与C组比较，5-FU组、5-FU+HRS组和5-FU+HRS+Nico组海马组织中M1型巨噬细胞面积增大、M2型巨噬细胞面积减小(P均<0.05)，HRS组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)；与5-FU组比较，5-FU+HRS组海马组织中M1型巨噬细胞面积减小、M2型巨噬细胞面积增大(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠海马组织中巨噬细胞分型变化

注：与C组比较，*P<0.05；与5-FU组比较，#P<0.05。

2.3 各组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6、IL-10表达比较 与C组比较，5-FU组、5-FU+HRS组和5-FU+HRS+Nico组海马组织中IL-1β、IL-6表达上升而IL-10表达下降(P均<0.05)，HRS组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)；与5-FU组比较，5-FU+HRS组海马组织中IL-1β、IL-6表达下降而IL-10表达上升(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico组上各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠海马组织中IL-1β、IL-6、IL-10表达比较

注：与C组比较，*P<0.05；与5-FU组比较，#P<0.05。

2.4 各组小鼠海马组织中Sirtuin-1、NICD蛋白表达比较 与C组比较，5-FU组、5-FU+HRS组和5-FU+HRS+Nico组海马组织中Sirtuin-1总蛋白和核蛋白表达均下降而NICD总蛋白和核蛋白表达均升高(P均<0.05)，HRS组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)；与5-FU组比较，5-FU+HRS组海马组织中Sirtuin-1总蛋白和核蛋白表达均升高而NICD总蛋白和核蛋白表达均下降(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico组各指标差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 各组小鼠海马组织中Sirtuin-1、NICD蛋白表达比较

注：与C组比较，*P<0.05；与5-FU组比较，#P<0.05。

3 讨论

研究表明，临床常用化疗药物5-FU能够造成肿瘤患者记忆力、学习力、注意力、推理能力、执行力、集中力和空间感的损害[2]。因此，本研究采用5-FU连续腹腔灌注诱导CICI形成。本研究结果显示，与C组比较，5-FU组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间缩短，提示应用5-FU成功诱导CICI。Liu等[7]研究表明，连续应用2%富氢液可减轻脓毒症小鼠脑损伤；因此，本研究富氢液用药浓度采用2%，观察时点选择5-FU停用24 h后。本研究结果显示，与5-FU组比较，5-FU+HRS组小鼠5 min内的僵直时间、N臂停留时间延长，提示2%富氢液可减轻5-FU诱发化疗所致认知功能障碍，证实本研究中2%富氢液的给药方案是有效的。

M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞是巨噬细胞连续变化的两个极端，并发挥各自的生物学功能[8]。过度或持久的M1型极化能引起机体炎症反应持续放大，使促炎因子IL-6、IL-1β持续增高，造成炎症反应综合征[9]；在组织损伤修复及稳态重建中，M2型巨噬细胞通过高表达IL-10、低表达IL-12抑制炎症反应，与M1型反应相拮抗，在促进炎症的消退以及损伤修复中发挥重要作用[10]。而Notch通路作为调节巨噬细胞极化的重要通路之一[11]，通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过3次剪切,释放NICD入胞质；NICD进而转位进入细胞核,并与核内转录因子RBP-Jκ结合,形成NICD/RBP-Jκ转录复合体,调控下游靶基因的转录表达,发挥包含促炎在内的生物学效应，促进巨噬细胞由M2型向M1型转化[12]。本研究结果显示，使用2%富氢液能够有效降低5-FU造成的Notch通路激活，巨噬细胞向M1型极化以及促炎因子IL-6、IL-1β形成，提示2%富氢液减轻5-FU造成的CICI机制可能与抑制Notch通路激活从而抑制海马巨噬细胞向促炎型转化有关。

组蛋白乙酰转移酶(HAT)催化组蛋白与非组蛋白的乙酰化修饰，与基因转录激活密切相关；而HDAC则起着催化蛋白质的去乙酰化反应、抑制基因转录的作用。目前，在哺乳动物细胞中发现的HDAC亚型已有18种，Sirtuin属于HDAC3，共有7种亚型[13，14]。研究表明，小胶质细胞缺乏Sirtuin-1将引起小鼠认知功能障碍[15]；Sirtuin-1可通过去乙酰基化作用抑制NF-κB，激活蛋白-1、p53等抑制炎症反应[16]；同时离体实验也曾发现，Sirtuin-1的去乙酰基化作用对Notch通路具有负性调节作用，可抑制NICD形成以及转位进入细胞核启动的促炎反应[17,18]。本研究结果显示，2%富氢液在下调NICD的同时上调Sirtuin-1的表达，故我们推测富氢液的抗炎作用与上调Sirtuin-1从而抑制Notch通路有关。为进一步证实Sirtuin-1的这一作用，我们采用了Sirtuin-1的抑制剂Nicotinamide，后者通过非竞争性结合的方式抑制Sirtuin-1的生物活性；结果表明，该药物的使用阻断了富氢液对Notch通路的抑制以及巨噬细胞向M2型的极化，从而削弱了富氢液的认知保护作用。这提示2%富氢液对5-FU所致CICI的缓解是通过上调Sirtuin-1从而抑制Notch通路来减轻巨噬细胞向促炎型极化实现的，后期我们将加用Notch通路抑制剂完善这一假设。

综上所述，富氢液可减轻5-FU化疗所致小鼠认知功能障碍，其机制与上调Sirtuin-1表达抑制Notch通路激活，从而抑制巨噬细胞向促炎型转化有关。