miR-150在肺癌细胞中表达变化及其对细胞增殖能力的影响和机制

张靖雯，孙亚娇，王东，陈复辉

(哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150086)

肺癌是最常见的恶性肿瘤，在全球癌症相关死因中位居第一[1]。目前，虽然许多分子靶点已经确定可以改善肺癌的治疗疗效，但患者5年总生存率仍约为16%[2]。因此，进一步寻找肺癌发生发展新的分子机制，对肺癌患者的治疗及生存质量提高具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类由19～25个核苷酸构成的小分子非编码单链RNA，其通过结合靶基因mRNA的3′非翻译区，调控基因转录后表达水平[3]，在肿瘤细胞增殖、凋亡及其他生物过程中起关键作用[4]。研究报道，miR-150在肺癌组织中高表达，且高表达患者预后较差[5]，并可以通过调控上皮间质转化(EMT)促进肺癌的侵袭和转移[6]，但其在肺癌增殖中的作用及机制尚未明确。2017年1月～2018年10月，我们以肺癌细胞株A549为研究对象，观察miR-150在肺癌细胞增殖中的作用，为开发肺癌基因治疗新靶标提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺癌细胞A549、人肺正常上皮细胞16HBE均购自美国ATCC细胞库，DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；MTS细胞增殖及细胞周期检测试剂盒、蛋白裂解试剂均购自南京凯基生物技术有限公司，逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒等均购自日本TaKaRa公司。miR-150抑制物、miR-150模拟物(mimics)、内参GAPDH和c-Myc、Cyclin D1的引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，脂质体2000、TRIzol均购自美国Invitrogen公司；兔抗人c-Myc抗体(ab39688)、兔抗人Cyclin D1抗体(ab134175)、鼠抗人GAPDH抗体(ab8245)及BCA试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组转染 将细胞培养在37 ℃、5% CO2全湿度培养箱中，A549细胞培养基为含10% FBS的DMEM-F12，16HBE细胞培养基为含10% FBS的RPMI1640。A549细胞细胞呈对数生长期时，将细胞铺至6孔板；贴壁24 h后将细胞分为抑表达组、促表达组和对照组，抑表达组、促表达组按说明书将脂质体2000分别与miR-150抑制物、miR-150 mimics转染至细胞，对照组不转染，置于培养箱中培养48 h。

1.2.2 miR-150表达检测 采用qRT-PCR法。设计miR150引物上游为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′、下游为5′-TTCGCA GATACGACCACTGG-3′，GAPDH引物上游为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′、下游为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。取A549、16HBE细胞及各组转染细胞，采用TRIzol法裂解细胞提取总RNA。将RNA逆转录成cDNA，以GAPDH为内参基因进行荧光定量PCR。每个样品设置3个反应复孔，按两步法进行反应，分析各样品的循环阈值(Ct)，用2-ΔΔCt法分析miR-150相对表达量。重复实验3次。

1.2.3 A549细胞增殖能力观察 采用MTS法。取各组细胞，以2×103/孔、150 μL培养基接种于96孔板，每组设6个平行复孔，置于培养箱中培养；分别在铺板后24、48、72 h时，各孔加入MTS工作液30 μL；培养箱中孵育2 h后，扫描酶标仪490 nm波长处测取光密度(OD)值。OD值越高提示存活细胞数越多，细胞相对增殖能力越强。重复实验3次。

1.2.4 A549细胞克隆形成能力观察 采用平板克隆形成实验。取各组细胞，以3×102/孔、2 mL培养基接种于6孔板，每组设3个平行复孔，置于培养箱中培养；培养1周时，各组转染试剂重复加入各组孔中1次，继续培养1周；弃掉培养基，PBS洗3次，加1 mL甲醇固定15 min；晾干后加入1 mL苏木素染色30 min，双蒸水冲洗后晾干；扫描拍照，计数肉眼可见克隆团。重复实验3次。

1.2.5 A549细胞周期检测 采用流式细胞术。取各组细胞，以1×106/管接种3管；PBS洗3次后，以预冷的70%乙醇固定24 h；PBS洗2次后，加入500 μL的PI染色工作液(12.5 μL的PI储存液，5 μL的RNase储存液)，混匀后37 ℃温箱中避光孵育30 min。PBS洗1次后，上流式细胞仪检测各周期细胞比例。重复实验3次。

1.2.6 A549细胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA检测 采用qRT-PCR法。设计c-Myc引物上游为5′-TCCCTCCACTCGGAAGGAC-3′、下游为5′-CTGGTGCATTTTCGGTTGTTG-3′，Cyclin D1引物上游为5′-TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC-3′、下游为5′-TCTCCTTCATCTTAGAGGCCAC-3′。取各组细胞，qRT-PCR法同1.2.2，按说明书操作，用2-ΔΔCt法分析c-Myc、Cyclin D1 mRNA相对表达量。重复实验3次。

1.2.7 A549细胞中c-Myc、Cyclin D1蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，加入500 μL/孔的蛋白裂解液(含5 μL的蛋白酶抑制剂和5 μL的磷酸酶抑制剂)，超声裂解30 min；4 ℃下以12 000 r/min离心30 min，将上清转移至新的EP管中，BCA试剂盒测蛋白浓度；煮沸变性后，每孔加50 μg蛋白行SDS-PAGE电泳；经湿转将蛋白转移至PVDF膜，8%脱脂牛奶封闭3 h；加入GAPDH、c-Myc、Cyclin D1一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次后，加入二抗孵育室温孵育2 h；ECL化学发光法曝光条带，扫描拍照。采用Quantity One V4软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH蛋白条带灰度比值表示目的蛋白表达量。重复实验3次。

2 结果

2.1 A549、16HBE细胞miR-150表达比较 A549细胞中miR-150相对表达量为10.21±0.06，高于16HBE细胞的1.00±0.10(P<0.05)。

2.2 A549细胞转染后miR-150表达比较 抑表达组、促表达组和对照组miR-150相对表达量分别为0.18±0.09、9.43±0.24、1.00±0.10，miR-150相对表达量促表达组>对照组>抑表达组(P均<0.05)。说明miR-150抑制物和模拟物作用较强，可继续后续的功能实验。

2.3 各组A549细胞增殖能力比较 见表1。

表1 各组A549细胞增殖OD490值比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 各组A549细胞克隆形成能力比较 抑表达组、促表达组合对照组细胞克隆形成数目分别为(60.68±9.49)、(286.58±15.90)(167.15±11.37)个，细胞克隆形成数目促表达组>对照组>抑表达组(P均<0.05)。

2.5 各组A549细胞周期比较 见表2。

表2 各组A549细胞各周期细胞比例比较

注：与对照组比较，#P<0.05。

2.6 各组A549细胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达比较 见表3。

表3 各组A549细胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达比较

3 讨论

随着医学技术的不断进步，虽然人们在蛋白及基因分子水平对肺癌的发病机制有了新的认识，以及肺癌的手术、放化疗及靶向药物等联合治疗的应用，但肺癌的早期诊断率和预后并没有好转的趋势[7，8]。目前，肺癌的发病机制尚未完全明确。因此，研究新的候选癌基因有望成为提高肺癌诊断及改善预后的关键。miRNA作为高度保守的一类小分子非编码单链RNA，在多种信号通路中发挥重要作用[9，10]。研究发现，miRNA在多种肿瘤组织中表达异常，可作为肿瘤诊断的早期指标，并且与患者的预后密切相关；因其具备癌基因和抑癌基因的作用，还可作为肿瘤治疗的潜在靶点[11，12]。

miR-150因在正常造血作用中具有重要的调节作用而被较早鉴定出来[13]。Dezhong等[14]在前列腺癌组织中观察到miR-150表达上调，并与肿瘤的复发转移呈正相关；周毅波等[15]研究发现，miR-150可通过上调其靶基因Nanog促进鼻咽癌细胞的增殖与侵袭。而最近研究也发现，miR-150高表达与非小细胞肺癌的侵袭和迁移有关[16]，但miR-150高表达与肺癌增殖的关系尚不清楚。本研究发现，miR-150在A549中表达高于16HBE,采用miR-150抑制物和mimics转染A549细胞进一步研究miR-150在肺癌细胞中发挥的作用;转染miR-150抑制物后细胞中miR-150表达降低，功能实验显示细胞增殖能力和平板克隆形成能力下降；转染miR-150 mimics后细胞中miR-150表达增多，功能实验显示细胞增殖能力和平板克隆形成能力增强。上述结果提示，高表达miR-150可促进肺癌细胞增殖。

肿瘤为一类细胞周期紊乱性疾病，大部分癌基因与抑癌基因发挥作用的最终效应都会汇集到细胞周期，而细胞周期不受控制将导致细胞异常增殖而促进肿瘤的发生[17]。因此，为了深入研究miR-150促进肺癌细胞增殖的作用机制，我们进一步采用流式细胞仪检测细胞转染miR-150抑制物和mimics后细胞周期的变化；结果显示，转染miR-150抑制物后G1期细胞比例增多，表明细胞周期明显阻滞在G1期；转染miR-150 mimics后G2期细胞比例增多，表明细胞周期明显阻滞在G2期。这提示细胞中miR-150表达减少，使细胞阻滞在G1期而不能进入到S期、G2期以及细胞有丝分裂期，成功地抑制了细胞增殖；而细胞中miR-150表达增多，使细胞阻滞在G2期而不能进入到细胞有丝分裂期，抑制了细胞增殖，与本研究miR-150表达增多促进细胞增殖现象是相矛盾的。研究发现，G2细胞周期的停滞可能存在肿瘤发展的早期阶段，G2期细胞增多是由于c-Myc基因表达增多，导致G2期阻滞的细胞变成非整倍体，即核内复制[18]。因此，考虑miR-510增多导致的G2期细胞增多可能是c-Myc基因的表达增多引起的，最终导致的结果是促进细胞增殖。

c-Myc是调节细胞增殖、迁移和血管生成的癌基因[19]，可作为转录因子异位至细胞核发挥作用；其靶基因较多，而与细胞周期有关的细胞周期蛋白Cyclin D1即为其中之一。本研究结果显示，与对照组比较，抑表达组c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达量下降，促表达组c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白增加。这提示细胞中c-Myc和Cyclin D1表达水平与miR-150表达水平一致，表明miR-150可能通过促进c-Myc和其靶基因Cyclin D1的表达促进肺癌细胞的增殖。

综上所述，肺癌A549细胞miR-150表达增加；miR-150可能通过上调c-Myc、Cyclin D1表达促进细胞周期的进程，进而增强肺癌细胞的增殖能力。因此，miR-150是肺癌A549细胞活化增殖潜在的靶向分子，可为干预和预防肺癌提供实验室数据和新的思路。