膀胱癌组织、细胞中长链非编码RNAs H19表达变化及其对细胞增殖的影响和机制

郭宗华，孔东波，江波涛，邹伟，饶志刚，赵克栋

(咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院，湖北咸宁437100)

膀胱癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌进展与肿瘤的恶性增殖密不可分，wnt/β-catenin信号通路在肿瘤细胞增殖中起重要作用。大量研究表明，膀胱癌发病机制是由遗传和表观遗传改变的累积引发的复杂过程。长链非编码RNAs (LncRNAs)属于非编码RNA，在转录和转录后水平调控基因的表达变化，参与调控肿瘤的恶性生物学行为。H19是一种LncRNAs，是肿瘤发生发展的关键因素[1]。有研究认为，H19是一种促癌因子，与肿瘤的增殖、侵袭、转移和耐药等均密切相关[2～5]。2016年6月～2018年6月，我们观察了H19在膀胱癌组织及细胞中的表达变化，并探讨其对膀胱癌细胞增殖的影响及作用机制，旨在为H19作为膀胱癌潜在治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 膀胱癌组织 收集2016年12月～2017年12月入住我院行手术切除的膀胱癌患者40例，标本收集前未行任何抗肿瘤治疗，未合并其他肿瘤、传染病。患者男29例、女11例，年龄(54.39±14.98)岁，肿瘤分期T1～T2期27例，T3～T4期13例，淋巴结转移16例，行膀胱部分切除术23例、根治性切除术17例，组织学分级低分化18例、高分化22例。另取同一时段良性膀胱疾病行手术切除的正常膀胱组织20例，患者中男11例、女9例，年龄(57.02±18.21)岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书，两组性别、年龄具有可比性。组织均经两位及以上病理专家确诊，切除的组织标本立即保存于-80 ℃液氮中。

1.1.2 细胞与试剂、仪器 人膀胱癌细胞EJ、T24、 J82和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购自美国ATCC细胞库；RPMI1640、DMEM-F12培养基、FBS购自美国Gibco公司；H19、内参GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；H19 siRNA(si-H19)和阴性对照siRNA (si-NC)购自广州瑞博公司；MTS购于南京凯基生物技术有限公司；流式周期检测试剂购自齐一生物科技有限公司；蛋白裂解试剂、蛋白浓度BCA检测试剂购自美国Thermo公司；wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1、cMYC抗体均自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 膀胱癌组织和细胞中H19检测 采用qRT-PCR法。以TRIzol裂解液氮冻存的组织以及膀胱癌细胞、正常膀胱上皮细胞，提取其总RNA。测定RNA浓度后，按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA；以cDNA为模板，按SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：H19上游5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′、下游5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′，GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′、下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.2.2 细胞培养及转染 选取H19表达最高的膀胱癌细胞，接种于含10% FBS的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2全湿度培养箱中培养。将呈对数生长的细胞铺至6孔板，细胞融合至90%左右时，随机分为抑表达组和对照组，用脂质体2000分别转染si-H19、si-NC，放至培养箱中培养。

1.2.3 细胞增殖能力观察 采用MTS法。转染48 h后收集细胞，用胰酶消化；以1.5×103/孔接种96孔板，每组设6个平行复孔，置于37 ℃培养箱中培养；48 h时每孔加入100 μL培养基和20 μL MTS工作液，继续孵育2 h，以全波长扫描仪检测490 nm波长处的吸光度(OD值)。细胞增殖率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.2.4 细胞克隆形成能力观察 采用平板克隆形成实验。转染48 h后收集细胞，用胰酶消化；以2×102/孔接种于6孔板，每组设3个平行复孔，置于37 ℃培养箱中培养；培养1周时再次转染，2周左右肉眼可观察到细胞克隆团；弃去培养基，以PBS洗3次；甲醇固定细胞15 min，晾干后加入苏木素染色30 min；晾干后扫描拍照，计数肉眼可见克隆团。

1.2.5 细胞周期检测 转染48 h后收集细胞，用胰酶消化后PBS洗3次；以1×106/管加入预冷的80%乙醇中固定24 h，每组设3个平行复孔；PBS洗3次后，按照流式周期检测试剂盒说明书加入PI染色液，置于37 ℃培养箱中避光孵育30 min，上流式细胞仪分析各期细胞比例。

1.2.6 细胞中wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测 采用Western blotting法。转染48 h后收集细胞，弃掉培养基；PBS洗3次后，加入RIPA蛋白裂解液；将细胞刮下后转移至EP管中，超声完全裂解后以12 000 r/min、4 ℃离心30 min；取上清，以BCA检测蛋白浓度；取50 μg蛋白上样，行SDS-PAGE电泳分离蛋白；湿转后，5% BSA室温封闭非特异蛋白2 h；加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，二抗室温孵育1 h；ECL法曝光条带，用Quantity One V4软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 膀胱癌组织中H19表达及其与临床病理特征的关系 H19在膀胱癌组织中相对表达量为1.28±0.44，高于正常膀胱组织的0.99±0.28(P<0.01)。膀胱癌组织中H19表达水平与临床病例特征的关系,见表1。

表1 膀胱癌组织中H19表达水平与临床病例特征的关系

2.2 膀胱癌细胞、正常膀胱上皮细胞中H19表达比较 H19在人膀胱癌细胞EJ、T24、J82中相对表达量分别为4.03±1.17、9.17±1.04、3.17±0.38，均高于人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的1.00±0.02(P均<0.05)，选取H19表达水平最高的T24细胞用于后续实验。

2.3 H19降表达对膀胱癌细胞增殖活性的影响 抑表达组细胞增殖率为31.85%±3.49%，低于对照组的100.00%±7.00%(P<0.05)。

2.4 H19降表达对膀胱癌细胞克隆形成能力的影响 抑表达组细胞克隆形成数为(56.32±10.66)个，少于对照组的(95.69±13.65)个(P<0.05)。

2.5 H19降表达对膀胱癌细胞周期的影响 见表2。

表2 H19降表达对膀胱癌细胞周期的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.6 H19降表达对膀胱癌细胞wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响 见表3。

表3 H19降表达对膀胱癌细胞wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

目前，靶向治疗在其他肿瘤中的治疗已成为标准。虽然，atezolizumab已经批准用于膀胱癌的靶向治疗[6]，但数量有限。因此，膀胱癌潜在治疗靶点的研究十分迫切。基因组中仅有2%的序列可以编码蛋白质，其余均为非编码RNAs。LncRNAs是一类新的非蛋白转录本，长度超过200个碱基，A其与miRNAs功能相似。LncRNAs与多种肿瘤类型相关，在肿瘤恶性增殖、侵袭转移、耐药及肿瘤干细胞等生物学过程中具有重要作用。研究发现，LncRNAs可以作为肿瘤治疗的药物靶点抑制肿瘤的恶性进展[7，8]。近年来越来越多的研究发现，膀胱癌中存在异常表达的LncRNAs，可能为膀胱癌治疗的潜在靶点。

H19属于最早被鉴定的LncRNAs之一，编码H19的基因位于11号染色体。H19在胚胎发生过程中保持较高的表达水平，而在正常条件下出生后的大多数组织中几乎检测不到。H19在哺乳动物的发育和生长过程中发挥重要作用[9]，其表达失调时会导致糖尿病性心肌病、缺血性脑卒中和恶性肿瘤等疾病的发生[1,10，11]。目前已经观察到，H19广泛高表达于各种肿瘤组织，为肿瘤促进因子。膀胱癌患者血清外泌体中H19表达水平与健康人和良性疾病患者相比显著增加，高水平H19与较低的生存率相关，可作为膀胱癌患者非侵入性诊断和预后生物标志物[12]。Zhu等[3]报道，与邻近组织相比，膀胱癌组织中H19表达水平增高，并且与晚期临床分期及转移相关；敲低膀胱癌细胞中H19的表达，E-钙黏蛋白表达增加，转移能力降低。本研究发现，H19在膀胱癌组织中表达升高，与已有的报道一致；同时发现，H19表达升高与肿瘤T分期相关，而与性别、年龄、淋巴结转移、手术方式、肿瘤分级等均无关，可能与本研究样本量小有关。而且，H19在膀胱癌细胞EJ、T24和J82中表达高于人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1，与在组织中的表达具有一致性。本文采用siRNA干扰T24细胞中H19的表达后，细胞增殖活力及克隆形成能力均降低，细胞周期阻滞在G1期。Lv等[2]报道，敲低膀胱癌细胞中H19的表达可抑制细胞增殖；宁伯彬[4]采用平板克隆实验同样发现，抑制H19表达后膀胱癌细胞克隆形成能力降低；而程卓夫等[5]报道，抑制H19表达后膀胱癌细胞周期阻滞在S期，可能与H19作用的机制不同有关。

干扰H19的表达，可能通过诱导细胞周期阻滞来抑制膀胱癌细胞增殖，其具体作用机制需进一步研究。在乳腺癌细胞中，H19通过拮抗miR-93-5p的调控作用，即下调其靶基因STAT3的表达，进而促进肿瘤细胞增殖[13]。在膀胱癌细胞中，H19可以与miR-29c-3p结合，降低miR-29c-3p对其靶基因CCND2表达的抑制作用，进而促进细胞增殖[5]。然而，肿瘤细胞增殖与多条经典信号通路均相关，包括STAT3、PI3K/AKT及wnt/β-catenin等信号通路，其中wnt/β-catenin在膀胱癌中是调控恶性增殖最常见的通路之一[14]。β-catenin是wnt经典信号通路的枢纽，其编码基因CTNNB1位于染色体3p21～22。在正常生理条件下，泛素化蛋白酶体降解β-catenin使其在细胞质内处于低表达状态；当细胞受到相应刺激信号时，β-catenin降解减少，细胞质中β-catenin增多后转移至细胞核中，促进下游靶基因的激活，发挥促肿瘤增殖的功能[15]。β-catenin下游包括数个靶基因，我们发现抑制H19表达可诱导膀胱癌细胞阻滞在细胞周期G1期，其中β-catenin的靶基因Cyclin D1和cMYC均与G1细胞周期的调控相关。Cyclin D1和cMYC表达增多，可促进细胞周期从G1期进入G2期。而本研究抑制膀胱癌细胞中H19表达后，细胞中β-catenin、Cyclin D1和cMYC蛋白表达均降低，表明H19可能通过激活wnt/β-catenin信号通路促进膀胱癌细胞增殖。

综上所述，H19在膀胱癌组织和细胞中表达升高，与膀胱癌患者肿瘤T分期相关；降低H19表达后，可通过调控wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞增殖。本研究发现了H19在膀胱癌细胞增殖中新的机制，为H19作为干预膀胱癌细胞恶性增殖的治疗靶点提供新的思路。