外源性硼酸在大豆制品——腐竹中的形态研究

马晓清 汪东风 徐 莹 袁永凯 孙 逊 刘成珍 钱怡霖

（中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266003）

硼元素是参与人体正常代谢过程中的重要非金属元素[1]，也是植物生长所必需的矿质元素[2-3]。植物源食品中均含有硼，其中大豆及大豆制品是我国常见食品中内源性硼含量（平均值）最多的食物，对我国居民的硼摄入量影响较大[4]。由于地区及饮食习惯的不同，人体日均硼摄入量区间为2～20 mg/kg[5]。硼酸常被不法商贩用来改善腐竹品质，研究表明过量摄入硼酸对人体有害[6]。我国1979年将硼酸和硼砂列为非法食品防腐添加剂，2008年又将其列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》 进行重点监督[7]。然而目前的检测手段难以区分腐竹中的硼是原料带入（内源性硼） 还是非法添加 （外源性硼酸）。李金林等[8]对大豆、腐竹中硼本底值进行调查，发现不同地区大豆、腐竹中硼本底值存在较大差异，若以此为标准判断腐竹中是否非法添加外源性硼，其结果会存在较大误差。

硼酸可与醇类化合物（尤其对邻二醇有较高的亲和性[9-10]）脱水形成硼酸酯类化合物（图1）。食品中存在大量多醇类化合物如糖类、蛋白等，这为硼酸在食品中生成单酯或二酯提供了有利条件。食品中可能存在不溶形态、游离形态、单酯形态以及二酯形态等硼化合物。黄丽等[11]研究发现大豆制品由于加工工艺不同，其硼形态存在较大差异，而外源性硼主要以硼酸和硼砂的形式进入食品，严重影响食品质量[12]。关于硼酸有害性研究，目前主要通过硼酸为硼源做动物实验[13]。然而，不同形态的硼化合物有不同的生理活性[14-15]，过量的硼酸对人体有较高的毒性；而另一种硼酸二酯形态的天然硼化合物——果糖硼酸钙[16]，却有较好的生物活性，以保健品的形式销售。有研究显示脱羧硼酸糖酯[17]可能将是一类新型功能成分。由此可知，不同形态以及不同含量的硼化合物其营养性和安全性均有较大差异。目前关于大豆等植物源食品中硼的安全性评估仍不全面，外源性硼在腐竹中的存在形态也未见报道。

本研究为了确定外源性硼在腐竹中的形态，在腐竹制备过程中添加不同量的外源性硼酸，利用以Sephadex G50 为填料的凝胶柱分离腐竹中不同形态的硼复合物，以期为检测腐竹中是否违禁添加外源性硼酸提供科学依据。最后利用11B NMR 进一步鉴定外源性硼酸在腐竹中的形态，为开发具有良好生物活性的食源性硼化合物提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

图1 硼酸的酯化反应Fig.1 Esterification of boric acid

1.1.1 材料与试剂 大豆，青岛市利群超市；Sephadex G50（Superfine），由GE Healthcare 公司生产；偶氮甲碱H（CAS：5941-07-1），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；DMSO-d6（D，99.9%），由美国CIL （Cambridge Isotope Laboratories，Inc）公司生产；硼标准液，国家有色金属及电子材料测试中心；Tris、EDTA·Na2，索莱宝生物科技有限公司；硼酸、乙酸铵、无水乙醚，国药集团化学试剂有限公司；层析柱（2.6 cm×100 cm），上海华美实验仪器厂；石英核磁管，美国NORELL 公司。

1.1.2 仪器设备 BSZ-100 自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司；豆浆机，中山市美斯特实业有限公司；核磁共振分析仪，美国安捷伦公司；高速万能破碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；GL-20B 型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；FD-3 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；兰格精密蠕动泵BT100-2J，保定兰格恒流泵有限公司；马弗炉，龙口市电炉制造厂。为避免硼污染，试验过程所用水均为超纯水，试剂均为分析纯级，容器均为塑料材质或石英材质。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备及前处理 腐竹制备的工艺流程：选豆→泡豆→磨浆→分离→煮浆（添加不同量的硼酸）→揭膜→提取腐竹→烘干[18-19]。

在煮浆过程中分别加入0%，5%，10%，15%，20%，30%（以大豆干重计）的外源性硼酸，并将制备的腐竹分别命名为：0%腐竹，5%腐竹，10%腐竹，15%腐竹，20%腐竹，30%腐竹。

水溶性硼酸及其酯类化合物的提取：分别称取一定质量的不同腐竹进行粉碎，采用索氏抽提法以无水乙醚为溶剂进行脱油脂处理[20]，称取脱除油脂后的腐竹粉末1.5 g，加入75 mL 超纯水（料液比1∶50），超声处理2 h，离心取上清液冷冻干燥，冻干样品置于干燥器中备用。

1.2.2 甲亚胺-H 法测定硼含量[21]

1.2.2.1 标准曲线制备 分别吸取硼标准使用液（10 mg/L）0，0.1，0.3，0.5，0.7，1 mL 于10 mL 聚丙烯管中加水至5 mL，加入2 mL 乙酸铵缓冲液（pH 5.6），再加入2 mL 甲亚胺-H 显色溶液，摇匀放置90 min 后在420 nm 波长处测定吸光度。以硼浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

1.2.2.2 样品测定 参照Lohse[21]的方法并稍作修改，测定冻干样品中总硼含量。称取10 mg 样品于瓷坩埚中，加1%Na2CO3溶液5 mL，电炉上慢热蒸干炭化至无烟，然后放入马弗炉500 ℃左右灰化完全，用2 mL 5%HCl 溶解坩埚中内容物，加水定容至50 mL，摇匀备用作测试溶液。取测试样液5 mL 按照1.2.2.1 中方法测定吸光值，计算含量。

1.2.3 Sephadex G50 分离硼酸及其复合物

1.2.3.1 Sephadex G50 预处理与装填[22]在室温下，将葡聚糖凝胶干粉浸泡于超纯水中24 h，并不断轻微搅拌以保证凝胶溶胀。将溶胀好的凝胶一次性装入柱内（2.6 cm×100 cm），保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层，装柱要均匀。用平衡液（pH 8，10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液）平衡层析柱至少3～5 个柱体积，直至流出液的pH 值为8。

1.2.3.2 Sephadex G50 分离硼酸标准液 参照Pfeffer 等[23]的方法并稍做修改，对标准硼酸溶液进行分离并测定含量，以确定标准硼酸的洗脱体积。洗脱液为pH 8，10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，用恒流泵控制流速为0.714 mL/min。分别配制200，300，400，500 μmol/L 的硼酸标准液，0.22 μm 滤膜过滤，上样10 mL，流出液用自动部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亚胺-H 法测定硼含量。

1.2.3.3 Sephadex G50 分离果糖硼酸复合物 配制一定浓度的硼酸果糖混合溶液（硼酸5 mmol/L，果糖500 mmol/L），搅拌30 min，0.22 μm 滤膜过滤，上样10 mL，流出液用自动部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亚胺-H 法测定硼含量。

1.2.3.4 Sephadex G50 分离腐竹中硼及其复合物按照1.2.3.2 中的方法条件，对样品中硼酸及其复合物进行分离并测定含量。准确称取0.0100 g冻干样品，溶于100 mL 超纯水中，0.22 μm 滤膜过滤，流出液用自动部分收集器收集于聚丙烯管中，10 mL/管；并用甲亚胺-H 法测定硼含量。

1.2.411B NMR 扫描[24]分别称取冻干样品10 mg 于0.5 mL 氘代DMSO 中充分溶解，并于石英核磁管中进行11B NMR 扫描。

1.3 数据处理

运用Excel 数据处理软件，所有数据均为3次重复试验的平均值。采用Origin 8.0 作图。

2 结果与分析

2.1 外源性硼酸在腐竹加工过程中的迁移行为

图2为外源性硼酸在腐竹加工过程中的迁移行为。从图中可以看出，腐竹中总硼含量随外源性硼酸添加量的增加而增加，并在外源性硼酸添加量为20%时趋于饱和。表明外源性硼酸在大豆制品加工过程中能够顺利迁移至腐竹中，且有较高的迁移率，进而改善腐竹品质，从侧面证明外源性硼酸与腐竹中某些物质反应生成硼酸酯类化合物。

2.2 Sephadex G50 分离硼酸及其复合物

图2 外源性硼酸在腐竹中的迁移行为Fig.2 Boron contents of yuba with different additional boric acid contents

2.2.1 Sephadex G50 对硼酸标准液的分离效果交联葡聚糖凝胶（Sephadex gel）是一种含有羟基的交联葡聚糖基质，具有多孔性三维空间网状结构的高分子化合物。虽然Sephadex 不含有顺式二醇羟基，但这种三维网状结构中羟基排列以及Sephadex G50 合适的孔径大小，提供了硼酸与其可逆性结合的可能性，使硼酸在适合的pH 值和洗脱流速条件下，在固定的体积中被集中的洗脱出来。图3为Sephadex G50 对不同浓度的硼酸标准液进行分离富集的结果。可以看出，随着标准硼酸液浓度的变化硼酸均从640～650 mL 体积开始被洗脱出来，并在690～700 mL 达到峰值，750～760 mL 洗脱完毕，即硼酸洗脱体积在640～760 mL 之间，其回收率为103%～107%。说明Sephadex G50对硼酸的洗脱体积较为稳定，且有较高的回收率。

2.2.2 Sephadex G50 对果糖硼酸复合物分离效果 果糖含有邻羟基，易与硼酸结合生成果糖硼酸二酯。由于Sephadex G50 具有多孔性三维空间网状结构以及适当尺寸孔径，与硼酸可逆结合形成不稳定的硼酸酯单酯，导致硼酸被延迟洗出，而果糖硼酸二酯先于硼酸洗出，从而使硼酸与果糖硼酸二酯被分离开来。将果糖与硼酸混合反应后利用Sephadex G50 分离，结果如图4所示。信号峰A 的洗脱体积为500～640 mL，信号峰B 的洗脱体积为640～730 mL，对比硼酸标准液洗脱体积，信号峰B 的洗脱体积与硼酸标准液基本一致，信号峰A 物质早于信号峰B 物质被洗脱出来。由此可知，信号峰A 为果糖硼酸二酯（结构式见图4），信号峰B 为硼酸。总硼回收率为98.10%，说明Sephadex G50 对硼酸及硼酸酯类化合物有较好的分离效果。

图3 Sephadex G50 分离硼酸标准液Fig.3 Elution diagrams of boric acid standard solution

图4 Sephadex G50 分离果糖硼酸混合溶液Fig.4 Elution diagrams of fructose and boric acid solution

2.2.3 Sephadex G50 对腐竹中硼酸及其复合物的分离 鉴于Sephadex G50 对硼酸标准液及硼酸酯类化合物的特异性，利用其对腐竹中的硼酸及硼酸酯类化合物进行分离。根据Sephadex G50 的特性可知，硼酸酯类化合物早于硼酸洗出。添加5%，10%，15%，20%，30%外源性硼酸的腐竹中硼物质的形态分布如图5所示。从图中可以看出，添加5%，10%，15%外源性硼酸的腐竹其总硼在体积为490～780 mL 之间被完全洗出，其总硼回收率为97%～112%。对比硼酸标准液，硼酸标准液的洗脱体积为640～760 mL 之间，腐竹样品有相对较宽的洗脱体积范围且有较早的出峰体积，在F1处均出现肩峰（图5中红色圆圈处），且洗脱完毕体积基本一致。结果表明：F1为硼复合物，F2为硼酸。F1与F2处总硼含量见表1。添加20%，30%外源性硼酸的腐竹中，其洗脱峰较为对称且没有肩峰，而在样品上样前添加一定量的硼酸（分别添加125，1 000 μg 硼酸），其洗脱结果出现肩峰，这是因为外加的硼酸大多在体积640～760 mL 洗出，不会在640 mL 体积之前洗出，从而使硼酸酯类化合物的信号峰凸显出来。

由此可知，在腐竹的加工过程中，外源性硼酸与腐竹中含有邻羟基的物质相结合形成稳定的硼复合物，而大部分的外源性硼酸在腐竹中以硼酸的形式存在。Sephadex G50 未能将腐竹中硼复合物和硼酸完全分离开来的原因可能是：（1）腐竹中复杂的成分对分离造成了干扰；（2）该硼复合物在该分离条件下受到一定程度的破坏；（3）游离硼酸所占比例较大，复合态硼所占比例较小，不利于将两者分离开来。

图5 不同外源性硼酸添加量的腐竹中硼形态分布Fig.5 Distribution of different forms of boron in yuba samples treated with different amount of extrinsic boron

表1 硼酸及硼复合物在不同腐竹样品中的含量Table1 Boric acid and boron complex content in different yuba samples

2.3 11B NMR 图谱分析

Sephadex G50 未能将腐竹体系中硼酸及硼酸酯类化合物完全分离开来，然而由于肩峰的出现也证明了硼酸酯类化合物的存在。因此，本研究利用11B NMR 进一步鉴定外源性硼酸在腐竹中的形态分布。图6分别为11B NMR 扫描样品0%腐竹，5%腐竹，10%腐竹，15%腐竹，20%腐竹，30%腐竹的结果。NMR 分析中，不同形态的硼在11B NMR 图谱上的化学位移不同，不同信号峰的积分面积之比等于不同形态硼含量之比，因此，可以通过计算11B NMR 图谱中不同信号峰面积比例确定各硼化合物含量之比。

从图6可以看出，样品10%，15%，20%和30%腐竹，均显示有3 种硼信号峰，而5%腐竹仅在20 ppm 处有一个较小的信号峰，这是由核磁扫描灵敏度较低所致。各信号峰化学位移见表2，信号峰a 为硼酸，信号峰b 为硼酸单酯，信号峰c 高度对称为硼酸二酯。结果表明，在腐竹加工过程中，外源性硼酸确实和大豆中某些含有邻羟基的物质相互结合。

图6 11B NMR 扫描不同外源性硼酸添加量的腐竹Fig.6 11B NMR spectra of different additional boric acid contents in yuba

腐竹中各信号峰积分面积之比见表3。从表3可以得出，外源性硼酸在腐竹中约84.7%～93.5%以游离硼酸形式存在，约6.5%～15.3%以复合态硼存在，且其比例与表1中各样品F1/F2值基本一致，即与Sephadex G50 分离结果一致。

表2 腐竹中11B NMR 信号峰化学位移Table2 The 11B NMR chemical shift of yuba

表3 腐竹中11B NMR 各信号峰积分面积比值Table3 The ratio of 11B NMR signal peak integral area of yuba

3 结论

在腐竹加工过程中，添加不同量的外源性硼酸，其在腐竹中的迁移量随外源性硼酸添加量的增加而增加，说明外源性硼酸能够顺利迁移至腐竹且有较高的迁移率，进而改善腐竹品质。这一结果从侧面证明外源性硼酸与腐竹中某些物质发生了反应。

利用Sephadex G50 对腐竹中硼酸及硼酸酯类化合物进行分离，发现其相对硼酸标准液有较宽的洗脱体积范围，并且在硼酸标准溶液洗脱体积之前均出现了肩峰，说明外源性硼酸在腐竹中并非完全以硼酸形式存在，硼酸在迁移过程中形成了硼复合物。这一结论为理清大豆制品腐竹加工过程中内、外源性硼的关系提供了重要参考，也为全面评估外源性硼对人体的危害性提供了新思路。

最后，本研究利用11B NMR 进一步鉴定外源性硼酸在腐竹中的形态分布。11B NMR 图谱中显示外源性硼酸在腐竹中主要以3 种形态存在，分别为硼酸、硼酸单酯、硼酸二酯，约84.7%～93.5%以硼酸形式存在，约6.5%～15.3%以硼酸单酯和硼酸二酯的形式存在，且这一结论与Sephadex G50分离结果基本一致。这一研究成果为开发具有良好生物活性的食源性硼复合物提供了重要价值。