胞壁酸研究进展

胡婕伦 刘丽萍 傅博强 聂少平 谢明勇*

（1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047 2 中国计量科学研究院医学与生物计量研究所 北京100029）

胞壁酸（Muramic acid），分子式为C9H17NO7。胞壁酸是细菌细胞壁中肽聚糖 （Peptidoglycan）结构的重要组成部分[1]，是原核微生物细胞的生物标志化合物[2]。1954年，Strange 和Powell 在数种芽孢杆菌的芽孢皮层中，Cummins 和Harris 在许多G+菌细胞壁中，通过Morgan-Elson 反应最先发现这一种酸性氨基六碳糖[3]；1956年，Strange 和Dark以离子交换法从芽胞肽的酸水解物中制出胞壁酸的纯结晶[3]；1959年，Strange 和Kent 确定该结晶的构造为2-氨基-3-O-（1-羧乙基）-2-脱氧-D-葡萄糖[3]。胞壁酸在相关酶的作用下发生乙酰基化反应，生成N-乙酰胞壁酸 （N-acetyl muramic acid），N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺 （Nacetyl-glucosamine，NAG）相互间隔，经β-1，4 糖苷键连接成长链，构成细菌细胞壁中肽聚糖的基本骨架。

作为原核微生物细胞的生物标志化合物，胞壁酸的应用范围十分广泛，常用于评价细菌或蓝藻的生物量，以此来推测不同环境中的微生物总量[4-15]。例如，检测从灰尘、土壤、沉积物、食品包装材料、 甚至动物组织等不同环境中采集的样品中的胞壁酸含量，可以推测出其中细菌的含量。胞壁酰二肽（MDP）中具有胞壁酸结构，MDP 是分枝杆菌细胞骨架中具有免疫佐剂活性的最小结构单位，具有重要的免疫学意义。MDP 可以激活巨噬细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞等多种免疫细胞，除此之外，对免疫物质如抗体、补体和细胞因子的生成和激活也有作用，对细胞免疫或体液免疫都具有广泛而重要的影响[16]。很多文献表明，胞壁酸是一种睡眠促进因子的组合物，此睡眠因子有利于提高人体免疫力。胞壁酸在植物凝集素、潜在细菌酶抑制剂，以及抗肿瘤作用等方面有很大的研究前景。近年来，许多科研工作者研究了胞壁酸的检测方法，目前文献报道的方法有自动氨基酸分析法、分光光度法、薄层层析法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效毛细管电泳法等。本文就胞壁酸的理化性质、生理功能和应用、检测方法进行概述。

1 胞壁酸理化性质

胞壁酸，化学名2-氨基-3-O-（1-羧乙基）-2-脱氧-D-葡萄糖，相对分子质量为251.23。分析其结构可知，胞壁酸是D-葡萄糖胺的C3 位与D-乳酸的C2 位的羟基以醚键连接而形成的产物。胞壁酸熔点较高，153 ℃，常温下外观呈固体粉末状，无气味。胞壁酸易溶于水，其水溶液呈弱酸性，pH值接近中性。胞壁酸的分子结构中含有较多羟基，极性大，比葡萄糖胺的极性小[17]。除易溶于水外，胞壁酸还可溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂[17]。胞壁酸的分子结构如图1所示。

图1 胞壁酸的化学结构Fig.1 Chemical structure of muramic acid

胞壁酸的化学性质比较活跃，易与酸碱反应，以离子形式存在溶液中。胞壁酸容易被强氧化性物质（如银离子、溴水）、强酸（如硫酸、硝酸）等氧化。此外，胞壁酸还可以被硝酸银、茚三酮、对甲氧基苯胺、联苯胺、苯胺-二苯胺、苯胺-邻苯二甲酸试剂等氧化染色，也可以和Ehrlich 试剂发生颜色反应[17]。胞壁酸是一种氨基糖，具有氨基糖的通性，在加热条件下，容易和氨基酸产生Maillard 反应和焦糖化作用[17]。

2 胞壁酸生理功能和应用

胞壁酸是细菌细胞壁中肽聚糖的组成成分，在检测各种环境中（例如土壤、食品、灰尘、组织等）的细菌含量时，胞壁酸常常作为一项重要检测指标。此外，胞壁酸也可作为临床医学检测中的一种抗体，有试验指出，胞壁酸不被溶菌酶所溶解，可激活补体，导致炎症反应，并能与γ 球蛋白起反应，可与人体黏膜细胞连结，减少细菌的吸附，其在致病中的作用还需要进一步研究阐明[18]。在目前现有的文献报道中，胞壁酸主要有以下生理功能和应用。

2.1 胞壁酸是微生物总量的重要评价指标

目前，胞壁酸最常用作微生物总量的标记物，以此来评价不同环境如土壤、灰尘、河水泥沙沉积物、食品包装材料，甚至动物组织等的微生物量。胞壁酸的含量不仅可以评价环境微生物含量的多少，还可以表示微生物的污染程度、表征土壤的肥力、代表组织的病变程度等。王晶等[19]在对土壤有机质的研究中介绍了一种新的量化指标，他们指出，微生物对土壤有机物有转化和积累的作用，这种作用的大小可以通过土壤中氨基糖的含量多少来评价，而土壤中的氨基糖主要有氨基葡萄糖（Glu）、氨基半乳糖（Gla）、氨基甘露糖（Man）和胞壁酸（Mur）等。其中，胞壁酸和氨基甘露糖的多少不仅可以反映细菌诱导氮在土壤中的下跌程度，还可以解释细菌对土壤有机质的转化和积累作用的大小[19]。从对土壤氨基糖浓度的研究中，可以发现微生物对土壤有机质（SOM）转化的线索，因为氨基糖的含量反映了土壤中微生物起源的有机态氮的特征[19]。张旭东等[20]研究表明，胞壁酸在当今已经引起较大的关注，他们经过大量的研究，得到了细菌是胞壁酸的唯一来源这一结论。Poole 等[21]为了测量不同农业环境中的胞壁酸、 麦角甾醇等化学成分，从猪舍、谷仓、储存室采集灰尘样本，推测出不同环境灰尘中的微生物群落诱导细胞炎症发生的能力不同。Mielniczuk 等[11]采集了食品包装材料和实验室环境中的灰尘样本，通过气相色谱-质谱联用方法检测其中胞壁酸含量，从而推测出食品包装材料和实验室环境中的灰尘中的细菌含量，为胞壁酸的检测提供了一种快速可靠的方法。总之，胞壁酸含量的多少可以评价环境中的微生物含量，表示微生物污染程度，表征土壤的肥力，代表组织的病变程度等。

2.2 胞壁酸可与豆科植物凝集素相互作用

Ayouba 等[22]研究比较了胞壁酸和N-乙酰胞壁酸在各种豆科植物外源凝集素中的抑制效力，采用血凝抑制技术研究半乳糖胺具体凝集素。研究结果表明，单糖和它们的衍生物可以跟植物凝集素产生特异性相互作用，与其它单糖和它们的衍生物相比，胞壁酸和乙酰胞壁酸跟植物凝集素产生的这种特异性相互作用更大。Ayouba 在此项研究中还发现了特异性凝集素与乙酰胞壁酸的交互作用导致不同的植物凝集素容易凝集一些细菌菌株，因为细菌细胞壁肽聚糖中乙酰胞壁酸的含量很高。Bourne 等[23]从山黧豆的种子里提取出一种凝集素，与细菌细胞壁中的胞壁酸和胞壁酰二肽相互作用形成复合物，研究这两种复合物精制的高分辨率的X 射线结构，发现凝集素对胞壁酸有较高的亲和力，说明植物对外源凝集素的选择是立体的。

2.3 胞壁酸在临床医学方面可作为一种检测抗体

广为使用的抗葡萄球菌溶血素测定（ASta）不甚敏感，在葡萄球菌心内膜炎的诊断上，胞壁酸抗体 （TAAs） 提供了一种十分有用的检查方法。Larinkari[24]研究了TAAs 在葡萄球菌菌血症中的面貌和TAAs 与ASta 试验之间的关系，证明了与抗葡萄球菌溶血素试验相比较，胞壁酸抗体试验在葡萄球菌菌血症的诊断检测上特异性大致相同，却更为敏感。在指导治疗金黄色葡萄球菌感染的患者时，可以检测其胞壁酸抗体，如果胞壁酸抗体呈阴性，则说明无并发症；如果胞壁酸抗体呈阳性，则需要延长治疗时间[18]。

2.4 胞壁酸是免疫佐剂的组成成分之一

很多学者研究改进胞壁酸和短肽链的人工合成方法，生成具有免疫佐剂、免疫调节剂等作用的生物活性物质，如胞壁酰二肽（MDP）、胞壁酰三肽等。现有的文献研究表明，MDP 及其类似物是一种强有力的免疫佐剂，对免疫系统有重要的生理作用。它可以激活多种免疫细胞，促进白细胞介素-1（lL-l）的产生，提高细胞免疫和体液免疫的功能，促进补体、扰体的生成和激活，除此之外，它在抗细菌、真菌、抑制肿瘤等方面也有明显作用[25]。MDP 是由N-乙酰胞壁酸和二肽链通过酰基连接形成的产物，MDP 类似物（如胞壁酰三肽、胞壁酰四肽等）的分子结构中也含有胞壁酸。

2.5 胞壁酸是一种睡眠促进因子的组合物

睡眠的好坏对人体免疫力的强弱有明显的影响，二者密切相关，优质睡眠有助于提高人体内淋巴细胞的数量。有专家研究指出，人体在睡眠时，大脑里会产生一种睡眠因子——胞壁酸，此睡眠因子不仅可以提高血液中的白细胞数量，激活巨噬细胞，而且可以增强肝脏的解毒功能，从而有效清除侵入人体的细菌和病毒，提高人体抗病能力[26]。Krueger 等[27]从人排出的尿中分离出睡眠促进因子化合物——小的糖肽，通过氨基酸-氨基糖分析表明该糖肽组成为谷氨酸、丙氨酸、二氨基庚二酸和胞壁酸，它们的物质的量比为2 ∶2 ∶1 ∶1。Krueger 等选择多名健康成年男性，采集了4.5 t尿液，对其进行分离和纯化，从中得到30 μg 这种小的糖肽。在实验兔子大脑内的侧脑室注射了这种睡眠促进因子，注射量为大约5 pmol/kg 体重，发现兔子的慢波睡眠增加了50%，根据电生理和行为标准判断，这种增加的睡眠是正常的，它类似于动物在长时间缺少睡眠后，被允许睡觉时进入的深度睡眠状态。

2.6 胞壁酸是复合糖化物的组成成分

很多复合糖化物中含有胞壁酸，它们具有生物活性，在生物体内发挥着重要的生理作用。糖复合物主要由糖链和非糖部分组成。糖链可以通过乙酰胞壁酸和其它氨基糖聚合而成，在此基础上再与肽链结合，从而形成各种肽聚糖、蛋白聚糖、糖蛋白等生物大分子，或者再与脂类连接，形成脂多糖和糖脂。糖复合物具有重要的生理功能，它不仅可以对物质成分进行识别，还可以影响蛋白质分子的生物活性[17]。Ottaviani 等[28]从软体动物的腹足中提取出了某种糖蛋白，对其结构进行分析，发现其中含有胞壁酸结构，这种胞壁酰糖蛋白可以替代唾液酸。

3 胞壁酸检测方法

在胞壁酸的检测分析方面，现有的研究文献中介绍了很多方法，各有优缺点。胞壁酸可以在自动氨基酸分析仪中直接进样分析。除此之外，最常见的检测方法是先用衍生试剂处理胞壁酸，将胞壁酸转化为对应的易挥发、稳定、有色的衍生化合物，再采用比色法、中红外光谱法、气相色谱法、气-质联用法、液-质联用法、高效液相色谱法、薄层色谱法等方法测定。样品处理的步骤不同，试验条件的不同，所选择的检测方法也不同。在具体的试验方案中，要根据样品特点、检测目的选择合适的检测方法。

3.1 氨基酸分析法

Moore 等[29]在1958年首先实现了氨基酸分析的自动化。他们将蛋白质水解生成的氨基酸通过阳离子交换色谱进行分离，再将分离出的各种氨基酸与柱后茚三酮试剂衍生结合，成功分析了多种氨基酸。胞壁酸分子结构中也存在氨基和羧基，与氨基酸分子有相似之处，因此也可用自动氨基酸分析仪来检测胞壁酸。张祝兰等[30]在对红色诺卡氏菌细胞壁骨架中的肽聚糖进行分析时，采用盐酸酸解样品，再将酸解后的样品通过氨基酸自动分析仪分析，从中发现了胞壁酸。

3.2 气相色谱法

气相色谱法选择性高，灵敏度高，分析速度快，应用范围广，然而要求样品气化，不适用于大部分沸点高和热不稳定的化合物[31]。胞壁酸沸点高，不能直接通过气相色谱仪检测，所以要根据实际情况选择合适的衍生试剂处理胞壁酸，将其转化成易挥发、对热较稳定的衍生物，再进样分析。在仪器分析领域，经常将气相色谱和质谱仪联用，对复杂的混合物进行分离分析，充分发挥这两种仪器的优势。Christensson[9]首次报道了使用气-质联用法检测感染的滑膜液（SF）中的胞壁酸，证明了胞壁酸可以作为一种化学标记证明类风湿关节炎中活细菌或细菌碎片的存在。Christensson 在12例败血症样品中确定了胞壁酸的可检测水平，同时发现，这些样品中的低细菌菌落计数的样品和20 名对照组患者的SF 样品中均未检测到胞壁酸。因此，败血症滑膜液中可检测的胞壁酸含量水平可以作为对反应性和类风湿性关节炎研究的阳性对照。Zhang 等[20]用盐酸水解土壤样品，得到4种水解产物并进行衍生反应，利用高分辨率的气相色谱装置同时确定这4 种衍生物，该方法敏感度较高，小于10 μg/mL 胞壁酸的和小于20 μg/mL的其它3 种氨基糖均被检出。苏华等[32]通过色-质联用法证明胞壁酸存在沙眼衣原体中。

3.3 高效液相色谱法

在对糖类物质的分析研究中，高效液相色谱（HPLC）法也是常用的一种方法。HPLC 分辨率高，分析速度快，分离效能高，灵敏度高，而且样品经过色谱柱后不被破坏，容易回收，有较大的应用范围[33]。采用HPLC 分析胞壁酸，样品经色谱柱分离后，进行柱后衍生，然后采用紫外-可见检测器检测，胞壁酸在199 nm 处有最大吸收波长[34]。Indorf等[13]对反相高效液相色谱法进行优化，通过邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生和荧光检测法测定土壤和植物水解产物中的胞壁酸、甘露糖胺、葡糖胺和半乳糖胺。改进后的方法保留时间减少，并通过改变流动相优化了胞壁酸和甘露糖胺的分离。Indorf等[13]还测定了激发波长、OPA 反应时间、四氢呋喃浓度和流动相的pH 值对氨基糖分离的影响。Zelles[35]研究了土壤样品中的胞壁酸和葡萄糖胺的最佳释放和定量估计。考察水解条件、HCl 浓度、水解时间、 土壤干重与酸的比例和参考物质回收率的影响。在土壤水解产物残留物中加入2-巯基乙醇，通过优化邻苯二甲醛与反应混合物中的水解产物的相对量、 两者的pH 以及温育条件来实现荧光试剂邻苯二甲醛的衍生化期，发现荧光响应与被测物质的浓度呈线性关系。使用高效液相色谱得到胞壁酸以及葡萄糖胺的邻苯二甲醛衍生物的单峰，并在短时间内实现了在皮摩尔水平下与干扰物质的完全分离。

3.4 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）设备简单，操作方便，容易显色，展开速率快，混合物易分离，但是对生物高分子的分离效果不太理想。高效薄层色谱法在多个领域中有广泛的应用。从胞壁酸的化学结构来看，含有较多羟基，极性大，在使用硅胶板进行分离时易形成氢键，不利于样品的展开，所以在分离胞壁酸时应该选择极性大的溶剂作为展开剂。Steven 等[36]采用异丙醇∶乙酸∶水（9∶1∶1）作为展开剂，分离河口沉积物沙渣里的胞壁酸，试验在27 cm（长）×8 cm（宽）×22 cm（高）的展开缸内进行，采用0.25 mm 厚的没有石膏粘合剂的未活化的Polygram Sil G（20×20 cm）薄层板，展开分离样品后，进行刮板溶解，再通过气-质联用法测定出海泥中的胞壁酸含量为11.3×10-12mol/g。

3.5 比色分析法

比色分析法简单易行，然而干扰因素多，测定结果不够准确。它的分析原理是样品中某种元素不同价态的离子或基团有该种离子或基团特定的颜色，这种颜色深浅与离子或基团的浓度有严格的线性关系，只要没有其它干扰因素，这种比例关系可以对样品溶液中的离子浓度进行分析。Taylor[37]修改了Barker 和Summerson 的测定乳酸的比色法，建立了一种简单而快速的测量乳酸、胞壁酸和甘油醛的比色分析法，该分析法可以在开放的试管中进行，而且不需要比分光光度计更复杂的设备。样品在加热的浓硫酸中释放乙醛，乙醛与硫酸铜和对苯基苯酚（pPP）反应，反应产物在570 nm处有吸收波长，可用分光光度计进行比色分析。

4 总结

胞壁酸有许多重要的生理功能，随着对胞壁酸的深入研究，胞壁酸的检测方法也得到了快速发展并不断改进，在食品卫生、临床医学、农业、环境污染监测等得到广泛应用。另外，近年来对糖的衍生物和复合物的研究十分活跃，随着对多糖和糖复合物的深入研究分析，人们对糖的功能有新的认识，取得了不少新进展，例如开发新型氨基糖苷类抗生素药物、免疫促进剂等。胞壁酸作为一种氨基糖，有广阔的开发前景。