亲水性色谱检测水产品中6种ATP关联化合物

张慧恩 王彩霞 杨 华*

（1 浙江万里学院生物与环境学院 浙江宁波315100 2 宁波御坊堂生物科技有限公司 浙江宁波315100）

新鲜度是水产品的重要评价指标，目前衡量水产品新鲜度最常用的指标是K 值。K 值是以水产品体内核苷酸在降解过程中产生的一系列化合物作为指标的鲜度判定方法[1]。活体水产品的肌肉运动和生理代谢都需要来自三磷酸腺苷（ATP）转化提供的能量，而水产品死后其体内所含的ATP在酶和微生物的共同作用下会降解为二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黄嘌呤核苷（HxR）和次黄嘌呤（Hx）[2]。K 值就是次黄嘌呤核苷（HxR）、次黄嘌呤（Hx）量之和与ATP 及降解产物总量的百分比[3]。K 值的大小，能反映鱼体在死亡至自溶阶段的新鲜程度，是水产品质评价的重要鲜度指标[4-5]。准确测定水产品中ATP 关联化合物对水产品的鲜度评价具有重要意义。

目前，K 值的测定方法主要通过各种分离手段，测定样品中各ATP 关联化合物的含量。常见的分离手段有毛细管电泳法[6-7]、离子色谱法[8]、反相高效液相色谱法[9-10]等。毛细管电泳对ATP 关联化合物的分辨率较高，而仪器昂贵；离子色谱法在分离过程中分离柱需要长时间平衡，分析时间长；反相高效液相色谱法具有操作简单，仪器普及等优点，如水产行业标准SC/T3048-2014 鱼类鲜度指标K 值的测定就是用反相高效液相色谱法测定，然而传统的反相高效液相色谱法分离核苷酸种类有限，特别是对ATP 关联化合物分析测定时，往往各组分之间的分离度较低，达不到完全分离的效果。目前，也有研究在反相高效液相色谱法中引入离子对试剂以提高分离效果[11-12]，然而离子对试剂的引入极易污染色谱柱，对色谱柱损耗较大，流动相平衡时间长，特别影响分析结果的重现性。而亲水性色谱（HILIC）能够增强极性物质在色谱中保留，从而提高分离效果[13]。亲水性色谱通过强极性固定性，结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现极性化合物的分离。传统的反相色谱对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相键合基团的脱落和反浸润。亲水性色谱对亲水性化合物有较强的保留能力，对亲水性化合物和极性化合物有广泛的选择性[14]。非常适用于分离测定ATP 关联化合物这类极性化合物。本研究利用亲水性色谱，建立了水产品中6 种ATP 关联化合物的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

银鲳（Pampus argenteus），宁波路林市场，-80℃保存。

标准品ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP，源叶生物；乙腈为Merck 色谱纯；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、高氯酸、氢氧化钾（均为分析纯级），国药集团。

1.2 仪器与设备

Waters 2695 高效液相色谱仪；Waters 2998二极管阵列检测器；JY92-ⅡDN 超声波细胞粉碎机，宁波新芝；QL-861 漩涡振荡仪，海门其林贝尔；冷冻离心机（eppendorf 5810R），艾本德公司；天平（Sartorius BSA124S），赛多利斯公司；pHS-3E pH 计，上海雷磁；色谱柱 BEH Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters 公司；Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），安谱实验科技公司。

1.3 样品处理

将鱼背脊上的去皮鱼肉均质后，取2.00 g，放入50 mL 离心管中，加入预冷的20 mL 高氯酸溶液（10%），涡旋混匀，冰浴超声裂解提取5 min。在4 ℃下离心8 000 r/min，10 min，取出上清液。再用10 mL 高氯酸溶液（10%）提取沉淀物，离心，合并上清液，用KOH 溶液将其中和至pH 6.5。先用10 mol/L KOH 溶液，接近至所需的pH 时，改用1 mol/L 的KOH 溶液，用流动相定容至50 mL，在4℃下离心8 000 r/min，15 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤，待测。

1.4 色谱条件

反相色谱分析条件：色谱柱Athena C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L 磷酸二氢钾和0.02 mol/L 磷酸氢二钾（1 ∶1）用磷酸调节至pH 6.0；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃，检测波长：254 nm。亲水性色谱分析条件：色谱柱BEH Amide （4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：A 2.0 mmol/L 磷酸二氢钾，B 乙腈，等度洗脱，A 20%，B 80%，流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃，检测波长：254 nm。

1.5 标准溶液及标准曲线

用流动相配制标准系列混标溶液，每种标样的浓度梯度为5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0 μmol/L，进样量10 μL，测定分析，根据保留时间定性，以峰面积与标样浓度做标准工作曲线。

1.6 数据处理

式中，M——样品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP 含量（μmol/g）；C——标准工作曲线上计算得到的样品中ATP、ADP、AMP、Hx、HxR、IMP含量（μmol/L）；V——样品定容体积（L）；m——称取的样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 样品处理方法

从食品或生物样品中提取ATP 关联化合物，最常用的方法是高氯酸提取[15]。我国水产行业标准SC/T3048-2014 鱼类鲜度指标K 值的测定也选用此法，这是因为样品中的蛋白质在高氯酸中能够很好的沉淀，减少蛋白质对分析的干扰。然而，加入高氯酸后，样品易形成块状不溶物，导致ATP关联化合物不能完全释放出来。采用冰浴超声可使块状不溶物迅速分散，保证提取的目标物充分进入溶液中，提取液用KOH 中和后，4 ℃低温放置2 h 可促进高氯酸钾析出，4 ℃下8 000 r/min，离心15 min 可将高氯酸钾沉淀去除。

2.2 色谱柱对分离效果的影响

通过反相色谱柱对6 种化合物进行分离，色谱条件参考水产行业标准SC/T3048-2014，其中流动相为0.02 mol/L 磷酸缓冲溶液pH 6.0。由于ATP 关联化合物基本都带有磷酸基团，结构相似，极性较大，反相色谱柱未能对几种物质进行分离，见图1。其中ATP 与IMP、Hx 与AMP 分离度均未达到1.5。流动相中不含有机相组分，这对反相色谱柱的使用和维护是非常不利的，在高水相的使用条件下色谱柱填料容易发生化学键合基团的失效甚至脱落，单一流动性的使用也使色谱分离过程中流动相的作用被忽视，如在传统反相色谱系统的流动相中加入少量有机相（如甲醇或乙腈），将加大流动相的洗脱能力，会使保留时间进一步减小，物质之间的分离效果将更差。

亲水性色谱柱因为固定相有极性官能团修饰（如氨基、酰胺基等），所以对极性化合物保留强，适合分离多肽、糖、核酸等物质[16]。通过亲水性色谱柱对6 种ATP 关联化合物进行分离，结果见图2。亲水性色谱对6 种ATP 关联化合物进行了较好的分离，与反相色谱相比，各物质的出峰顺序发生了变化，这是由于亲水色谱与反相色谱的分离机理不同，在反相色谱中增大有机相比例，洗脱能力增强，而在亲水色谱中要增大水相比例，洗脱能力才增强。在亲水色谱中ATP 的出峰最慢并且有些拖尾，这是由于ATP 分子带有的磷酸基团最多，极性最强，亲水色谱对其保留性最强，各物质的分离度均大于1.5。

2.3 磷酸二氢钾浓度的影响

亲水性色谱在分离时只使用单一成分的磷酸二氢钾，而不用配制磷酸缓冲溶液，试验中分别配制了2.0，4.0，6.0，8.0 mmol/L 的磷酸二氢钾溶液，流动相为磷酸二氢钾溶液20%，乙腈80%。结果显示，磷酸二氢钾浓度主要影响ATP 的峰形，对其它5 种物质的出峰时间和峰形影响不大，随着磷酸二氢钾浓度的增加，ATP 的出峰时间提前，峰形更差，拖尾严重。这可能是因为随着磷酸二氢钾浓度的增加，流动相中的离子强度增加，进一步抑制了ATP 分子与固定相之间的作用，从而使固定相对其保留能力减弱。因此，选择2.0 mmol/L 的磷酸二氢钾溶液作为流动相。

2.4 流动相中乙腈比例的影响

色谱常用流动相中乙腈与甲醇相比具有更小的紫外吸收，最适宜用于紫外检测器。在相同情况下，使用乙腈的柱压也小于甲醇，这有利于色谱柱的长期正常使用。而且甲醇是质子型试剂，在分离过程中能与ATP 关联物分子中的极性基团形成氢键，从而降低固定相对物质的保留作用，而乙腈是非质子型试剂，不会与分析物形成氢键[17]。试验比较了乙腈与2.0 mmol/L 磷酸二氢钾溶液的比例分别为95∶5，90∶10，80∶20，70∶30 情况下，对分析测定的影响。结果显示，不同比例的流动相对各组分的峰面积影响不大，只对出峰时间有影响，亲水色谱中流动相的洗脱能力随着水相比例的增大而加强，2.0 mmol/L 磷酸二氢钾溶液比例小于10%（体积比）时，色谱的出峰时间显著延长，因此本试验选用乙腈与2.0 mmol/L 磷酸二氢钾溶液的比例为80∶20，可以使样品在20 min 内完成分析，各组分的峰型也基本良好。

图1 反相色谱分析色谱图Fig.1 Chromatogram of Reversed phase HPLC

图2 亲水色谱分析色谱图Fig.2 Chromatogram of HILIC HPLC

图3 8.0 mmol/L 磷酸二氢钾溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of mobile phase containing 8.0 mmol/L KH2PO4

2.5 线性关系、检出限及定量限

试验考察了6 种ATP 关联化合物在一定浓度范围内的线性关系和相关系数。以6 种化合物的摩尔浓度（x，μmol/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数，同时以色谱峰的信噪比（S/N）大于3 时为方法检出限，（S/N） 大于10 时为定量限，结果见表1。由表1可以看出6 种物质均呈现良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.9950。

表1 回归方程、线性相关系数、检出限和定量限Table1 Regression equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

2.6 精密度与回收率

将标准品加入到2.0 g 样品中，各配制成3 个浓度梯度的加标量，进行样品提取和色谱分析，每个加标量做6 个平行，计算回收率。由表2可见，6种物质的平均回收率在82.0%～108.2%，相对标准偏差0.8%～6.4%，保留时间的相对标准偏差0.5%～2.0%。说明本方法重现性和准确度较好。

2.7 水产品中ATP 关联化合物的测定

应用本方法对不同保藏温度下的银鲳中ATP关联化合物进行测定。结果见图4、图5和表3。

根据K 值计算公式：

银鲳4 ℃保藏10 d，K 值78.4%，-40 ℃保藏10 d，K 值16.5%。一般认为即杀鱼的K 值在10%以下，新鲜鱼K 值大约在20%以下，20%～40%为二级鲜度，60%～80%为初期腐败鱼[3]。-40 ℃保藏10 d 的银鲳K 值16.5%为新鲜鱼，4 ℃保藏10 d的K 值78.4%已处于初期腐败。鱼体死后肌肉组织中的三磷酸腺苷（ATP）的降解途径是三磷酸腺苷 （ATP）→二磷酸腺苷 （ADP）→单磷酸腺苷（AMP）→肌苷酸（IMP）→次黄嘌呤核苷（HxR）→次黄嘌呤（Hx）。从测定图谱和结果上可见，两种保藏条件下的银鲳在IMP 含量上的差异，比其它5种物质更加明显，这是因为AMP 在脱氨酶作用下，脱氨形成肌苷酸（IMP），而IMP 形成后的降解过程相对缓慢，而且降解速度直接受肌肉保存温度的影响[18]。-40 ℃的保藏温度显著降低了鱼肉中IMP 的降解过程。

表2 加标回收率和精密度 （n=6）Table2 Determination results of sample and recoveries （n=6）

图4 4 ℃保藏10 d 银鲳中ATP 关联化合物Fig.4 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in 4 ℃for 10 days

图5 -40 ℃保藏10 d 银鲳中ATP 关联化合物Fig.5 HPLC chromatogram of Pampus argenteus preserved in -40 ℃for 10 days

表3 不同保藏条件下的银鲳ATP 关联化合物含量（n=3）Table3 Determination of ATP related compounds in Pampus argenteus under different preservation conditions （n=3）

3 结论

以乙腈-2.0 mmol/L 磷酸二氢钾为流动相，用BEH Amide 亲水性色谱柱，在254 nm 处对6 种ATP 关联化合物进行分离，与C18 反相色谱柱测定相比分离效果更优。在亲水性色谱中极性化合物更易被保留，流动相的洗脱能力随着水相比例的增加而增加，6 种ATP 关联化合物的出峰顺序与C18 反相色谱体系不同，依次是次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、单磷酸腺苷、肌苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷。本方法6 种ATP 关联化合物保留时间RSD 为0.5%～2.0%，峰面积RSD 为0.8%～6.4%，3个浓度梯度加标回收率在82.0%～108.2%，表明本方法重现性和准确度较好，是一种可靠性、实用性强的测定方法。