胡桃醌对类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响

左瑞庭，王西彬

［河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院），河南 郑州450002］

类风湿性关节炎是一种慢性、多关节性、系统性的自身免疫病，病理改变主要包括滑膜炎症，关节软骨和软骨的破坏等，其中以滑膜炎症为最主要的病理表现［1-2］。成纤维样滑膜细胞是构成滑膜组织的主要部分，在类风湿性关节炎滑膜病变中表现为异常活化增殖［3-4］，成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的失衡与类风湿性关节炎的形成关系密切［3］。因此，抑制类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）增殖并促进其凋亡对防治类风湿性关节炎具有重要意义。

胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的重要活性物质，具有明确的抗肿瘤作用，此外，还具有抗菌、抗炎、杀虫等药理作用［5-7］。胡桃醌具有显著调节细胞增殖的作用，如抑制成胶质细胞瘤细胞和宫颈癌细胞增殖，促进皮肤细胞增殖等［8-9］，可促进宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤等细胞的凋亡［10-12］。然而，目前为止还没有胡桃醌与RA-FLSs的增殖和凋亡之间关系的相关报道，故本实验对此进行研究。

1 材料

RA-FLSs 细胞株购自欧洲动物库。DMEM 高糖培养基和胎牛血清购自美国HyClone 公司；Akt 兔单克隆抗体、p-Akt 兔单克隆抗体（phospho S473）、p21 兔单克隆抗体、GAPDH 兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam 公司；BCA 试剂盒购自美国Pierce 公司；硝酸素纤维膜购自美国Promega 公司；MTT 购自上海生工公司；Annexin-V FITC／PI 试剂盒购自美国PharMingen 公司；BrdU 试剂盒购自美国Sigma 公司；SC79 购自碧云天公司。

2 方法

2.1 RA-FLSs 培养 RA-FLSs 由含有10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养基于5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达80%即可传代。

2.2 Annexin-V FITC／PI 检测细胞凋亡 利用Annexin-V FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，并按照试剂盒说明书进行。首先用磷酸盐缓冲溶液预冷细胞，然后用Annexin-V FITC（13 μL）于4 ℃孵育细胞28 min，PBS 洗细胞1 次，加入10 μL PI 孵育7 min，最后用流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况。实验重复3 次。

2.3 caspase-3 活性检测 收集细胞，按照试剂盒（BD ApoAlert Caspase-3 Fluorescent Assay Kit）说明书检测caspase-3 活性，记录结果。实验重复3 次。

2.4 MTT 法检测细胞活力 将RA-FLSs（5×104／孔）接种于96 孔板，不同浓度胡桃醌或Akt 激动剂处理，于5%CO2、37 ℃培养24 h 后，进行MTT 实验检测。首先，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL）继续培养5 h，去掉上清后每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），室温振荡溶解结晶甲瓒15 min，酶标仪测定溶液在490 nm 波长处的吸光度，结果为3 次重复试验的平均值。

2.5 BrdU 检测 利用BrdU 试剂盒检测细胞增殖，按照说明书进行操作。将RA-FLSs（5×104／孔）接种于96 孔板，不同浓度胡桃醌或Akt 激动剂处理后（对照组无胡桃醌和Akt 激动剂处理），于5%CO2、37 ℃培养24 h，每孔加入10 μL BrdU 后孵育1 h，轻轻去掉上清液，每孔加入变性溶液100 μL，孵育20 min 后，按照说明书相继加入BrdU 抗体和二抗，最后加入四甲基联苯胺（TMB）孵育25 min，酶标仪检测370 nm 波长处的吸光度以反映细胞增殖的变化。每组样品3 个复孔，每次实验重复3 次。

2.6 Western blot 检测 收集细胞，提取蛋白，利用BCA 试剂盒定量蛋白，将25 μg 蛋白于聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，半干法转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭膜2 h，一抗［Akt兔多抗（1∶ 500）、p-Akt 兔单抗（1∶ 500，phospho S473）、p21 兔单抗（1∶800）、GAPDH兔单抗（1∶1 000）］4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育1.5 h，利用凝胶成像系统观察结果，GAPDH 为内参对照蛋白。实验结果为3 次重复的平均值。

2.7 统计学分析 采用SPSS21.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示。2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胡桃醌对RA-FLSs 增殖的作用 与0 μmol／L胡桃醌比较，胡桃醌浓度为（30、40、50 μmol／L）时显著抑制RA-FLSs 的细胞活力和增殖能力（P＜0.01）。见图1。

3.2 胡桃醌对RA-FLSs 凋亡的作用 与0 μmol／L胡桃醌比较，胡桃醌浓度为（30、40、50 μmol／L）显著促进RA-FLSs 凋亡，并显著促进caspase-3 活性（P＜0.01）。见图2。

3.3 胡桃醌对Akt 活化和p21 蛋白表达的调节作用 与0 μmol／L 胡桃醌比较，30 μmol／L 胡桃醌能显著抑制p-Akt 蛋白表达，促进p21 蛋白表达（P＜0.01）。见图3。

图1 胡桃醌对RA-FLSs 增殖的影响Fig.1 Effects of juglone on the proliferation of RA-FLSs

图2 胡桃醌对RA-FLSs 凋亡的影响Fig.2 Effects of juglone on the apoptosis of RA-FLSs

图3 胡桃醌对Akt 活化和p21 表达的影响Fig.3 Effects of juglone on the Akt activation and p21 expression

3.4 胡桃醌通过调节Akt 磷酸化来调控p21 蛋白表达 与胡桃醌（30 μmol／L）比较，胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0、1.5、1.8 μg／mL）共同处理能显著促进Akt 磷酸化（P＜0.01），胡桃醌（30 μmol／L）和SC79（1.0 μg／mL）共同处理后p21 蛋白表达显著下降，显著抑制细胞凋亡，增殖能力显著升高（P＜0.01）。见图4。

4 讨论

类风湿性关节炎是常见的全身性自身免疫性疾病，主要侵犯关节滑膜，严重者可致关节变形，心、肺、肾等脏器也可受累［13］，其分布广，病程长，反复发作，具有发病率、致残率高的特点［14］。成纤维样滑膜细胞大量增生是类风湿关节炎发生的中心事件，在其病理机制中起关键作用［13］。胡桃醌属于萘醌类，是胡桃科植物胡桃及黑核桃中的重要活性物质，具有抗炎、抑菌和抗肿瘤的作用［15］，研究表明，它对细胞增殖能力具有调控作用；Wahedi 等［8］报道胡桃醌具有促进皮肤细胞增殖的作用，促进伤口愈合；Wang 等［16］研究发现胡桃醌可有效抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移；Hu等［17］报道表明胡桃醌对乳腺癌细胞系MCF7Adr 的增殖和侵袭能力具有抑制作用；Zhang 等［18］证实胡桃醌可诱导宫颈癌细胞系SiHa 的凋亡过程。在甲状腺低分化癌的细胞中，胡桃醌显著促进其凋亡［19］；同时，胡桃醌对肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞和黑色素瘤细胞的凋亡也具有诱导作用［12，20］，然而，目前为止仍没有研究表明胡桃醌对成纤维样滑膜细胞的增殖和凋亡是否有作用。本实验利用不同浓度胡桃醌孵育RA-FLSs 24 h，结果表明胡桃醌浓度为30 μmol／L 时显著抑制RA-FLSs 细胞的生长活力和增殖能力，同时显著促进RA-FLSs 细胞的凋亡，说明它可有效抑制RA-FLSs 增殖且促进其凋亡。

图4 胡桃醌调节RA-FLSs 增殖和凋亡的相关分子机制Fig.4 Molecular mechanisms of regulation of RA-FLSs proliferation and apoptosis by juglone

有报道表明，胡桃醌在乳腺癌细胞SKBR3 中可抑制Akt 的活化［21］；Li 等［22］发现抑制Akt 活性可促进血管平滑肌细胞中p21 的表达。Akt 又称为蛋白激酶B（PKB），是细胞增殖和凋亡的重要调控因子［23］，激活后具有促进骨肉瘤细胞、海马神经元和胆囊癌细胞增殖的能力［24-25］，Akt 活性被抑制后，诱导肝星状细胞和胃肠道间质瘤细胞［26-27］。p21 是已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，参与细胞的生长、分化、衰老及死亡过程［28］，Audo 等［29］发现p21 可诱导RA-FLSs 细胞的凋亡，p21 的下调推动细胞周期进程，导致RAFLSs 增殖［30］，但目前仍无研究表明RA-FLSs 中胡桃醌、Akt 和p21 之间的调控关系。本实验中胡桃醌（30 μmol／L）与不同浓度Akt 激动剂SC79 同时 孵育RA-FLSs 24 h 后显示，SC79 浓度为1.0 μg／mL时，p21 蛋白表达较胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 显著降低，表明胡桃醌可通过调节Akt 活性来调节p21 蛋白表达；胡桃醌（30 μmol／L）与SC79（1.0 μg／mL）同 时 孵育RA-FLSs 24 h 后，细胞凋亡率降低、增殖能力升高较胡桃醌（30 μmol／L）孵育RA-FLSs 24 h 明显，表明在RA-FLSs 中胡桃醌可通过调节p21 蛋白表达来调控细胞增殖和凋亡，与文献报道p21 对RAFLSs 增殖和凋亡的作用一致［29-30］。因此，胡桃醌可通过Akt 来调节p21 蛋白表达，进而抑制RAFLSs 增殖和促进其凋亡。

综上所述，胡桃醌具有抑制RA-FLSs 细胞增殖和促进其凋亡的作用，并可通过调控Akt 磷酸化调节p21 蛋白表达。胡桃醌对p21 的调节实现了它对RA-FLSs 增殖和凋亡的调控作用，可为治疗类风湿关节炎提供更多的参考。