金银花总黄酮自微乳处方的优化

赵惠茹，石大玉，靖 会，肖 呈，周 喆，张一帆

（西安医学院药学院，陕西 西安 710021）

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，为临床常用中药，具有疏散风热、清热解毒的功效［1］，其总黄酮有抗氧化、抗炎、抗心律失常、抑菌、保肝等作用［2-3］，但其水溶性差，相关口服制剂（金银花糖浆、复方金银花颗粒等）生物利用度低，从而限制药效发挥，影响临床应用。文献［4-6］报道，将金银花总黄酮制成自微乳可能会提高其水溶性，但目前尚无相关研究。

自微乳是由油相、乳化剂、助乳化剂组成的一种新型药物载体，在温和搅拌下遇水可自乳化成粒径小于100 nm 的水包油型乳剂，在增加难溶性药物溶解度、促进药物吸收、提高生物利用度、避免药物水解和对胃肠道不良刺激方面具有明显优势，近年来已广泛用于药物制剂开发中［7-8］。其中，筛选处方是最核心的部分，故本实验拟将金银花总黄酮制成自微乳，并采用单纯形网格法优化其处方，为相关新剂型研发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ZEN3600 型激光粒度仪（英国Malvern公司）；UV762 型紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；KQ5200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA1004B 型电子精密天平（上海越平科学仪器有限公司）；TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-2000A 型旋转蒸发器、DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试药 芦丁对照品（含有量≥99%，批号100080，上海源叶生物科技有限公司）；金银花总黄酮（批号180326，自制，以芦丁计算含有量为74.6%）。金银花购于西安市万寿路药材市场，经西安医学院药学院边军昌高级实验师鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾。D101 大孔吸附树脂（陕西蓝深科技有限公司）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40）、聚氧乙烯蓖麻油（EL-35）（德国巴斯夫公司）；曲拉通（X-100，成都市科龙化工试剂厂）；吐温-80（天津富宇精细化工有限公司）；辛酸癸酸三甘油酯（上海千为油脂科技有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（国药集团化学试剂有限公司）；油酸乙酯（天津市光复精细化工研究所）；聚乙二醇400（天津市科密欧化学试剂有限公司）；1，2-丙二醇（天津市北联精细化学品开发有限公司）；异丙醇（天津市河东区红岩试剂厂）。其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含有量测定［9］精密称取芦丁对照品20.0 mg，置于50 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定容，得0.400 mg／mL 对照品溶液，精密移取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠0.4 mL，摇匀，静置6 min；10%硝酸铝0.4 mL，摇匀，静置6 min；4%氢氧化钠4 mL，加水定容至刻度，摇匀，静置15 min，以相应试剂为空白对照，在510 nm 波长处测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A=4.366 1X+0.011 3（r=0.997 1），在0.04～0.16 mg／mL范围内线性关系良好。

2.2 总黄酮制备

2.2.1 提取［10］称取药材粗粉适量，置于索氏提取器中，石油醚连续回流至提取液无色后取出晾干，加入10、8、6 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，提取液合并，减压浓缩至无醇味，6倍量蒸馏水搅拌溶解，12 h 后离心，上清液减压浓缩至适当浓度，备用。

2.2.2 纯化［11-12］将预处理好的D101 大孔吸附树脂倒入烧杯中，加入总黄酮浓缩液静态吸附12 h，将达到吸附饱和的树脂装入层析柱中，依次用6 BV 蒸馏水、5 BV 30%乙醇洗脱除去杂质，再用5 BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，即得总黄酮。精密称取干燥至恒重的总黄酮50 mg，置于25 mL 量瓶中，70%乙醇溶解定，精密移取2.0 mL 置于25 mL 量瓶中，按“2.1”项下方法测定吸光度，测得总黄酮含有量为74.6%。

2.3 处方筛选

2.3.1 溶解度 精密称取聚氧乙烯氢化蓖麻油RH-40、曲拉通X-100、聚氧乙烯蓖麻油EL-35、吐温-80 这4 种乳化剂，以及异丙醇、聚乙二醇400、1，2-丙二醇、无水乙醇这4 种助乳化剂各4 g，置于具塞离心管中，加入过量总黄酮，在20 kHz频率、室温下超声1 h 辅助溶解后37 ℃水浴中静置24 h，3 000 r／min 离心10 min，吸取适量上清液，甲醇稀释至适宜浓度，按“2.1”项下方法测定吸光度，计算溶解度，结果见表1。由表可知，总黄酮在聚氧乙烯氢化蓖麻油RH-40、吐温-80、无水乙醇、1，2-丙二醇中的溶解度较大，故选择前两者作为乳化剂，后两者作为助乳化剂进一步筛选自微乳油相。

表1 总黄酮溶解度测定结果Tab.1 Results of solubility determination of total flavonoids

2.3.2 油相与乳化剂配伍 将辛酸癸酸三甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯这3 种油相与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40、吐温-80 这2 种乳化剂按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 比例混合后，加入100 倍量超纯水，400 r／min 磁力搅拌，按文献［13］方法根据乳化时间和液体颜色观察乳化情况。结果，油酸乙酯与吐温-80 配伍时乳化时间短，所需乳化剂少，乳化效果好，故选择前者作为油相，后者作为乳化剂。

2.3.3 助乳化剂 按照油酸乙酯、吐温-80、助乳化剂2∶4∶4 的比例加入助乳化剂无水乙醇、1，2-丙二醇，400 r／min 磁力搅拌均匀后加入100 倍量超纯水磁力搅拌乳化，记录从加入超纯水开始磁力搅拌至完全分散、形成外观澄清或有蓝白色乳光均一微乳所需的时间，即为乳化时间。结果，加入2 种助乳化剂后乳化时间均分别缩短至24、37 s，考虑到无水乙醇易挥发，故选择1，2-丙二醇作为助乳化剂。

2.3.4 各组分比例范围［14］先将吐温-80 与1，2-丙二醇按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 比例混匀，再与油酸乙酯按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5 比例混匀后，称取0.5 g 滴加到50 mL 超纯水中，400 r／min 磁力搅拌，记录可形成外观澄清或有蓝白色乳光的均一微乳处方中各组分比例。再以油相、乳化剂、助乳化剂为相图3 个顶点，Origin8.0 软件绘制伪三元相图，结果见图1，根据微乳区域的边界确定油酸乙酯、吐温-80、1，2-丙二醇比例范围分别为10%～30%、30%～70%、10%～50%。

2.4 处方优化

图1 自微乳伪三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram for self-microemulsions

2.4.1 试验设计［15-17］根据“2.3”项下处方筛选结果，结合单纯形网格法比例约束，确定自微乳中各组分比例为油酸乙酯（X1）10%～25%、吐温-80（X2）45%～60%、1，2-丙 二 醇（X3）30%～45%。再以自微乳平均粒径（Y1）、多分散指数（Y2）、载药量（Y3）为评价指标，Design Expert 8.0.6 软件进行设计，按处方比例精密称取油相、乳化剂、助乳化剂，400 r／min 磁力搅拌10 min后加入过量总黄酮，混匀，在20 kHz 频率、室温下超声1 h 辅助溶解，静置24 h，即得自微乳。过滤后，精密称取0.5 g 置于50 mL 量瓶中，超纯水稀释并定容，摇匀，3 000 r／min 离心10 min，移取适量上清液，测定平均粒径、多分散指数，按“2.1”项下方法测定吸光度，计算载药量，公式为载药量=总黄酮质量／自微乳质量，结果见表2。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

2.4.2 模型拟合及方差分析 通过Design Expert 8.0.6 软件进行多元回归模型拟合，得方程分别为Y1=-77.772 60X1-77.945 24X2-19.639 91X3+11.678 00X1X2+5.708 27X2X3+20.655 94X1X3-0.441 59X1X2X3、Y2=-0.005 48X1+0.012 17X2-0.004 11X3、Y3=-0.051 34X1-0.072 01X2+0.197 74X3。再进行方差分析，可知各模型P＜0.000 1，失 拟 项P＞0.05，回 归 方 程 系 数R2＞0.80，表明模型拟合度良好。

2.4.3 响应面分析 见图2。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5 验证试验 自微乳粒径越小，粒径分布越窄，越有利于药物的溶出与吸收；载药量越大，实际服用剂量越少，越便于临床应用。因此，综合考虑3个指标，以平均粒径、多分散指数符合要求并尽可能小，载药量最大为指标，Design Expert 8.0.6 软件进行优化，得最优处方为油酸乙酯、吐温-80、1，2-丙二醇比例10∶45∶45。再根据优化处方制备3 批自微乳，进行验证试验，结果见表3、图3，可知处方稳定可行。

3 讨论

图3 自微乳粒径分布Fig.3 Particle size distribution of self-microemulsions

本实验采用D101 大孔吸附树脂分离纯化金银花总黄酮时，依次用适量纯化水和30%乙醇除杂，再用70%乙醇洗脱，发现纯度较高，粒径较预实验没有除杂所得的自微乳减小，载药量显著增大，说明理化性质差别较大的杂质会对其形成产生特殊影响。因此，在对中药有效部位自微乳处方进行研究时，应尽可能采用多种纯化方法提高其纯度。

本实验首先根据金银花总黄酮在几种备选乳化剂、助乳化剂中的溶解度初步筛选，然后通过油相、乳化剂的配伍实验来确定种类，接着筛选助乳化剂，根据伪三元相图确定各自比例范围，最后用单纯形网格法进一步优化。这与测定总黄酮在各种备选油相、乳化剂、助乳化剂中的溶解度来筛选处方不同，主要是因为即使总黄酮在某种油相中的溶解度最大，与乳化剂、助乳化剂配伍后未必是最优处方，甚至有时候并不能形成稳定的微乳，还需要进一步选择溶解度次之的油相去配伍。为了减少油相、乳化剂、助乳化剂配伍次数，避免盲目性筛选，本实验略去了总黄酮在各种备选油相中的溶解度数据。

由于金银花总黄酮在无水乙醇中的溶解度大于1，2-丙二醇，故预实验以其为助乳化剂，伪三元相图微乳区域各组分的比例分别为10%～40%油酸乙酯、30%～80% 吐温-80、10%～60% 无水乙醇，但用单纯形网格法优选时有个别处方不能形成稳定的微乳，可能是由于搅拌时无水乙醇挥发，从而使各组分比例发生变化，降低了稳定性，故选用对金银花总黄酮溶解能力较好、不挥发的1，2-丙二醇作为助乳化剂。另外，采用单纯形网格法优选处方时，14 组实验形成的空白微乳均为澄清或略泛蓝色，并均能在室温下稳定存在。

处方筛选优化是自微乳制剂研究最关键的部分，目前可应用正交试验、均匀设计实验、星点设计-效应面法等进行研究，每种方法都有其优缺点。其中，基于Design Expert 8.0.6 软件试验设计、模型构建、结果预测的单纯形网格法是采用空间图形淘汰法进行处方优选，通过因素之间的相互约束来影响指标，在确定处方组成的响应面和最佳范围方面优势独到，尤其适合自微乳这类组分总量恒定的剂型，而且考察因素数目相同时实验次数少于星点设计-效应面法，不必连续进行多次试验，预测结果准确。综上所述，单纯形网格法拓宽了自微乳处方筛选方法，可为相关优化研究提供新思路。