HPLC法同时测定六味木香丸中4种成分

徐 僮，杜 欢，李 琪，王 张，张 静，范 刚

（成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137）

六味木香丸为常用藏药成方制剂，又名“如达柱巴”，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（藏药分册），具有止吐、止疼的功效，可用于治疗“培根木布”引起的疼痛、嗳气、腹胀、呕吐等［1］，主要由木香、巴夏嘎、余甘子、豆蔻、荜茇、石榴子6 味药材组成。其中，木香为君药，气浓香，性凉，味苦，能清烦热，调和气血，消积去食，可用于“培根”聚滞、烦热［2］；余甘子、石榴子为臣药，前者性凉、锐，能清血热、健胃消食、生津止咳，主治培根病、消化不良症［3］，而后者性温，能开胃，助消化，可治疗胃病、培根病、一切培龙病［4］。现代研究表明，六味木香丸具有明显的抗炎、镇痛、抗胃溃疡损伤作用［5-6］，在质量控制方面，已有采用HPLC 法测定木香烃内酯、去氢木香内酯含有量的报道［7-9］，但尚未涉及其他成分。因此，本实验建立HPLC 法同时测定六味木香丸中鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯的含有量，以期为提高该制剂质量控制水平提供参考依据。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置二极管阵列（DAD）检测器、自动进样器、柱温箱（美国Agilent 公司）；SB5200D 型超声波清洗机（宁波新艺超声设备有限公司）；UPLC-1-10T 型超纯水机（成都优普超纯水科技有限公司）；DZKW-S-4 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；BSA124S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

六味木香丸9 批（批号20170708、20180620、20180620、20180620、20180815、20180905、20180912、20180912、20180915），主要购于西藏、青海、四川等地藏医院和藏药厂。木香烃内酯（批号111524-201710）、去氢木香内酯（批号111525-201711）对照品购于中国食品药品检定研究院；胡椒碱（批号PS010640）、鞣花酸（批号PS010827）对照品购于成都普思生物科技股份有限公司，含有量均大于98%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，20%～28% A；12～15 min，28%A；15～20 min，28%～55% A；20～35 min，55%～60%A；35～45 min，60%～65%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取去氢木香内酯、木香烃内酯、鞣花酸、胡椒碱对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇分别制成3.152、1.400、3.212、4.132 mg／mL 贮备液，各精密量取5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇制成每1 mL 分别含四者0.315 2、0.140 0、0.321 2、0.413 2 mg 的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备 精密称取丸剂粉末约2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，密塞，称定质量，水浴回流提取40 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 取缺荜茇、木香及石榴子、余甘子的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 专属性考察 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，阴性无干扰，方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成6 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 对照品溶液在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积RSD 分别为1.16%、1.22%、1.21%、1.24%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一批供试品溶液（批号20170708），于 0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯峰面积RSD 分别为0.98%、0.24%、0.19%、0.21%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 精密称取同一批丸剂（批号20170708）粉末6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香烃内酯含有量RSD分别为1.83%、1.98%、1.96%、1.10%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取同一批丸剂（批号20170708）粉末6 份，每份约1.0 g，按100%水平加入鞣花酸（4.794 mg／mL）、胡椒碱（3.776 6 mg／mL）、木香烃内酯（2.349 mg／mL）、去氢木香内酯（5.810 6 mg／mL）对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.11 样品含有量测定 取各批丸剂粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行3 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选 木香为六味木香丸君药，木香烃内酯、去氢木香内酯是其主要有效成分，具有明显的抗炎、抗肿瘤、抗胃溃疡等作用［10］；余甘子、石榴子用量较大，为臣药，均含有没食子酸、鞣花酸等鞣质，具有明显的抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性［11-12］；胡椒碱是荜菝中主要有效成分，具有抗炎、抗氧化等作用［13］，这些药理活性与该制剂治疗慢性胃炎、胃溃疡等疾病基本吻合。本实验曾尝试测定六味木香丸中没食子酸含有量，但发现该成分极性较大，出峰时间很快，不能与其他极性较大的杂质峰分离，而且其专属性不强，故最终选择木香烃内酯、去氢木香内酯、鞣花酸、胡椒碱作为指标成分。

3.2 HPLC 色谱条件优化 本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸流动相，发现以乙腈-0.2% 磷酸为流动相梯度洗脱时，分离效果最佳。此外，还对色谱柱、检测波长、柱温等条件进行了研究，发现在WondaSil C18色谱柱、柱温30 ℃、检测波长210 nm 条件下各成分分离度、峰型、对称因子最佳。

3.3 提取条件优化 本实验考察了提取方法（回流、超声、冷浸）、提取溶剂（70% 甲醇、50% 甲醇、甲醇、无水乙醇、纯水）、提取时间（20、30、40、50 min）、溶剂用量（25、50、70 mL），发现50 mL 70%甲醇回流提取40 min 时，提取效果最佳。

3.4 含有量测定分析 9 批六味木香丸中均检测出胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯，平均含有量分别为0.19%、0.11%、0.27%；鞣花酸平均含有量为0.08%，但有2 批未检测出，而且差异较大，可能是原药材来源不同造成的。余甘子、石榴子中均含有鞣花酸，文献［14-15］报道，不同产地2 种药材中其含有量明显不同。因此，为了控制六味木香丸质量，在收集原药材时要注意保证余甘子、石榴子来源的稳定性。

4 结论

本实验首次建立HPLC 法同时测定六味木香丸中鞣花酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯的含有量，该方法简便可行，准确性、重复性较好，可为该制剂质量控制及标准建立提供参考。