基于网络药理学的“白芍-桂枝”药对治疗类风湿关节炎作用机制研究Δ

张林华，吴嘉瑞，姜 迪，孟子琦，张景媛

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029； 2.北京市卫生局临床药学研究所，北京 100035)

白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，性微寒，味苦、酸；入肝、脾经；具有养血敛阴、柔肝止痛和平抑肝阳等功效；临床用于治疗头疼、眩晕、肋痛腹痛、四肢挛痛、月经不调及自汗盗汗等症。药理研究结果表明，白芍具有抗炎、抗免疫和镇静镇痛等药理作用[1]。桂枝为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，味辛、甘，性温；入心、肺、膀胱经；具有散寒解表、温通经脉和通阳化气之功效；临床多用于风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿及心悸等病症。药理研究结果表明，桂枝具有缓和肠胃刺激、强心、改善微循环、抗炎和抗血小板聚集等多种药理活性[2]。中药是多组分、多靶点及其组分间协同作用的复杂体系，因其成分复杂，系统庞大，使其深入研究呈现出巨大困难。网络药理学为复杂中药系统的研究提供了新的思路，融合了系统生物学和多向药理学的思想，从整体观念出发，探索药物与疾病的关联性，强调从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，阐释中药的多成分-多靶点的作用关系，已被广泛应用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测以及中药作用机制的探索[3-5]。本研究基于网络药理学方法，探讨“白芍-桂枝”药对治疗类风湿关节炎的作用机制。

1 资料与方法

1.1 化学成分的构建

依托中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)，检索与白芍、桂枝相关的所有化学成分，其中与白芍有关的化学成分85个，与桂枝相关的化学成分220个，两者含有的相同成分7个，故“白芍-桂枝”中含有的相关化学成分共298个。

1.2 口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug-likeness，DL)预测

基于样品量、数据的复杂性以及综合文献的考虑，，选择OB≥30%、DL≥0.18作为化合物分子的筛选条件，通过条件筛选，298个化合物分子中有17个符合条件，将其作为候选化合物。

1.3 “化合物-靶点蛋白”网络的构建

通过TCMSP平台寻找与17个化合物相关的潜在靶点，将候选化合物与其潜在的靶点蛋白生成一个体现药物靶点相互作用的网络图。使用Cytoscape 3.7.0软件构建“化合物-靶点”网络。Cytoscape 3.7.0是一款可以图形化显示网络并可进行分析和编辑的软件，支持多种网络描述格式，也可以用Microsoft Excel等文件作为输入源，或者利用软件本身的编辑器模块直接构建网络。

1.4 类风湿关节炎相关靶标蛋白质的收集

治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)是一个提供已知或正在探索的可用作治疗的蛋白质靶点和核苷酸靶点的信息，以及与之相对应的靶疾病、靶通路和相应药物/配体信息的数据库。以“rheumatoid arthritis”为关键词进行搜索，收集与类风湿关节炎相关的蛋白。

1.5 “化合物-疾病靶点”网络的构建

分析“白芍-桂枝”药对对应的化合物靶点以及疾病对应的靶点，通过Cytoscape 3.7.0软件绘制“化合物-疾病靶点”网络。

1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

为了说明“白芍-桂枝”药物治疗类风湿关节炎的潜在作用靶点在基因功能和信号通路中的作用，采用David v6.8数据库(http://david.ncifcrf.gov/home.jsp)对“白芍-桂枝”药对活性成分潜在靶点网络中的蛋白进行GO功能富集分析和基于KEGG的生物通路富集分析，绘制气泡图，并利用Cytoscape 3.7.0对KEGG通路富集分析中的信号通路构建“药对-化合物靶点-通路”网络。

2 结果

2.1 候选化合物基本信息

“白芍-桂枝”药对中含有的17个候选化合物有良好的OB和DL，见表1。

表1 候选化合物基本信息Tab 1 Basic information of candidate compounds

2.2 化合物-靶点相互作用网络分析

将17个化合物及其潜在的靶标相连，构建化合物-靶点相互作用网络图，见图1。化合物-靶点相互作用网络包含105个节点(11个化合物和94个潜在靶点)和142条边，因有6个化合物在该数据库中并未找到相关的靶点，故构建的化合物-靶点网络中只显示11个化合物。在网络图中，长方形节点代表化合物，圆形节点代表靶点，1个节点的度表示网络中和节点相连的路线条数。如每个长方形的度表示候选化合物分子所拥有的靶点数目；而每个圆形的度则代表相应靶点所相关的候选化合物分子的数目。由图可见，分子M422(kaempferol，山奈酚)有最多的潜在靶标(62个)，其次为M358(beta-sitosterol，β-谷甾醇)(37个潜在靶标)，然后是M492[(+)-catechin，儿茶素]和M4576(taxifolin，紫杉叶素)(均有11个潜在靶标)。上述数据表示，度值高的药物分子有可能在“白芍-桂枝”药对的药理功能中发挥着较为重要的作用。儿茶素可以通过抑制关节炎大鼠滑膜细胞亢进的代谢、增殖和分泌功能来发挥抗炎作用[6]。山奈酚能够明显改善骨质疏松大鼠骨小梁的形态结构[7]。

图1 “白芍-桂枝”化合物-靶点相互作用网络图Fig 1 Network of molecular-target interaction of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

2.3 类风湿关节炎相关的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络

TTD中检索到88个与类风湿关节炎相关的一级蛋白，见表2。

2.4 与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对化合物-潜在靶点网络

将“白芍-桂枝”药对“活性成分-预测靶点”网络和与类风湿关节炎相关的PPI网络合并，从网络中删除没有交集的蛋白，直观得到“白芍-桂枝”药对中活性成分治疗类风湿关节炎的靶点。节点间的连接原则为“白芍-桂枝”药对中活性成分作用靶点与类风湿关节炎靶点相同时，将活性成分与类风湿关节炎联系起来，相同的靶点则为“白芍-桂枝”药对中活性成分治疗类风湿关节炎的潜在靶点。在STRING 10.5数据库中检索，选取分值>0.4的高置信度蛋白质，并得到PPI网络，见图2。将STRING 10.5数据库中得到的数据以及相交靶点对应化合物导入Cytoscape 3.7.0软件中，构建与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对“活性成分-潜在靶点”网络，见图3；图中，长方形表示化合物，圆形表示疾病靶点。图3的网络中得到12个节点(5个化合物，7个靶点基因)，22条相互作用关系。通过STRING 10.5数据库的进一步扩展，将数据再次导入Cytoscape 3.7.0软件中进行化合物及疾病靶点基因网络的构建，见图4；图中，长方形表示化合物，椭圆形表示一级蛋白，菱形表示二级蛋白，节点大小与节点的度值成正比。图4的网络中包含32个节点，190条相互作用关系(连线)。将度值≥15的蛋白质节点列出，见表3。结果显示，度值最高的为“IL6”“JUN”其次为“TNF”“MAPK8”“FOS”和“MAPK1”。说明上述蛋白质在网络中发挥了关键的作用，成为联通网络的桥梁。白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖和分化以及炎症反应中发挥着重要作用。IL-6是由淋巴细胞或非淋巴细胞产生的一种多功能细胞因子，在机体免疫应答、急相反应和造血调控中发挥重要作用。IL-6通过刺激骨吸收的调节作用，进一步刺激破骨细胞的前体细胞，激发破骨细胞活性，促进骨质吸收，导致骨质破坏[8]。TNF通过旁分泌作用，在组织损伤局部可产生高浓度，引起成骨细胞凋亡，进而影响骨代谢、骨平衡。TNF参与机体的免疫调节和炎症反应[9]。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用David平台的GO和KEGG通路富集分析功能，对与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对“活性成分-潜在靶点”网络中涉及的32个蛋白在信号通路中的作用进行研究。在GO富集分析中，根据错误发现率(false discovery rate，FDR)确定了32个GO条目(FDR<0.1)，并做相应的气泡图，见表4、图5。其中，信号通路包括TNF信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、NOD样受体通路和Toll样受体通路；疾病通路有乙型肝炎、南美锥虫病(美洲锥虫病)、弓形虫病、沙门菌感染、结直肠癌、类风湿关节炎和破骨细胞分化等通路。由表4可见，生物过程相关条目22个，涉及转录因子的活性调节、IL-6介导的信号通路、破骨细胞分化的正调控、炎症反应和转录因子活性调节等方面；分子功能相关条目9个，涉及转录因子活性、转录因子结合等方面；细胞成分相关条目1个，即IL-6受体复合物。通过KEGG分析，得到81条信号通路，根据FDR<0.05筛选出35条通路，将这35条通路数据列出并做相应的气泡图，见表5、图6。将“白芍-桂枝”药对、化合物、靶点及KEGG通路导入Cytoscape 3.7.0的数据库中，构建“药对-化合物-靶点-通路”网络，见图7。

表2 与类风湿关节炎相关的88个蛋白Tab 2 88 proteins associated with rheumatoid arthritis

表2(续)

序号基因名称蛋白质名称65N/A“ProteinTat”(蛋白质Tat)66PNP“Purinenucleosidephosphorylase”(嘌呤核苷磷酸化酶)67ROCK2“Rho-associatedproteinkinase2”(Rho相关蛋白激酶2)68S1PR1“Sphingosine1-phosphatereceptor1”(鞘氨醇1-磷酸受体1)69SGPL1“Sphingosine-1-phosphatelyase1”(鞘氨醇1-磷酸裂合酶1)70ESRRA“SteroidhormonereceptorERR1”(类固醇激素受体ERR1)71MMP3“Stromelysin-1”(基质分解素1)72CD4“T-cellsurfaceglycoproteinCD4”(T细胞表面糖蛋白CD4)73CD80“T-lymphocyteactivationantigenCD80”(T淋巴细胞活化抗原CD80)74CD86“T-lymphocyteactivationantigenCD86”(T淋巴细胞活化抗原CD86)75JUN“TranscriptionfactorAP-1”(转录因子AP-1)76TSPO“Translocatorprotein”(转运蛋白)77TNF“Tumornecrosisfactor”(肿瘤坏死因子)78TNFSF11“Tumornecrosisfactorligandsuperfamilymember11”(肿瘤坏死因子配体超家族成员11)79TNFSF12“Tumornecrosisfactorligandsuperfamilymember12”(肿瘤坏死因子配体超家族成员12)80TNFRSF1A“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember1A”(肿瘤坏死因子受体超家族成员1A)81LTBR“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember3”(肿瘤坏死因子受体超家族成员3)82CD40“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember5”(肿瘤坏死因子受体超家族成员5)83FAS“Tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember6”(肿瘤坏死因子受体超家族成员6)84TYR“Tyrosinase”(酪氨酸酶)85BTK“Tyrosine-proteinkinaseBTK”(酪氨酸蛋白激酶BTK)86JAK1“Tyrosine-proteinkinaseJAK1”(酪氨酸蛋白激酶JAK1)87JAK3“Tyrosine-proteinkinaseJAK3”(酪氨酸蛋白激酶JAK3)88SYK“Tyrosine-proteinkinaseSYK”(酪氨酸蛋白激酶SYK)

图2 相交靶点的PPI网络Fig 2 PPI network of intersecting targets

图3 “白芍-桂枝”药对“化合物-疾病靶点”网络图Fig 3 Network of compound-disease target of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

3 讨论

类风湿关节炎是一种严重的慢性自身免疫性炎症性疾病，多发于手、足小关节，严重者导致关节畸形，甚至功能丧失，具有对称性。该病在全球都有分布，发病率约为1%。中医药具有良好的临床疗效以及毒副作用小等特点，常用于临床治疗中。白芍具有抗炎、免疫调节和保肝等药理作用；桂枝具有抗菌、抗病毒、解热镇痛、镇静、抗炎以及免疫调节等药理作用。白芍配伍桂枝具有协同作用，抗炎作用显著提高。本研究构建“白芍-桂枝”药对“活性成分-预测靶点”网络，构建与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对“活性成分-潜在靶点”网络，进而系统分析“白芍-桂枝”药对治疗类风湿关节炎的作用机制。

图4 扩展后的“化合物-靶点基因”网络图Fig 4 Extended compound-target gene network

序号蛋白质基因节点的度值1IL6232JUN233TNF214MAPK8215FOS206MAPK1207PTGS2198MAPK3189STAT31810CREB11711MAPK91612MMP11513FOSL11514TNFRSF1A1415ATF31416FOSB1317IL17A1318TIMP11219FOSL21120NFATC211

表4 与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对潜在靶点GO条目Tab 4 Potential target GO entry of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus” related to rheumatoid arthritis

图5 GO条目的气泡图Fig 5 Bubble chart of GO entry

图6 KEGG通路的气泡图Fig 6 Bubble diagram of KEGG pathway

表5 与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对潜在靶点KEGG富集通路Tab 5 Potential target enrichment analysis of KEGG of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus” related to rheumatoid arthritis

图7 “白芍-桂枝”药对“药物-化合物-靶点-通路”网络图Fig 7 Network of drug-compound-target-pathway of “Paeoniae Radix Alba-Cinnamomi Ramulus”

与类风湿关节炎相关的“白芍-桂枝”药对“活性成分-潜在靶点”网络中包含27个靶点，分别为“IL6”“JUN”“TNF”“MAPK8”“FOS”“MAPK1”“PTGS2”“MAPK3”“STAT3”“CREB1”“MAPK9”“MMP1”“FOSL1”“TNFRSF1A”“ATF3”“FOSB”“IL17 A”“TIMP1”“FOSL2”“NFATC2”“IL6R”“TNFRSF1B”“MAPK10”“ALOX5”“IL6ST”“AKR1B1”和“ALOX5AP”。其中，度值>20的靶点为“IL6”“JUN”“TNF”和“MAPK8”，推测“白芍-桂枝”药对有效成分可能通过上述靶点发挥作用。白细胞介素对类风湿关节炎骨破坏有调控作用。关节软骨及骨破坏是类风湿关节炎的主要病理变化，是患者致残的主要原因[8]。从KEGG得到的通路图列表中可见，第1个通路，即“Osteoclast differentiation”(hsa04380)，为破骨细胞分化。破骨细胞在类风湿关节炎骨破坏的病理过程中起着关键作用，其调控依赖于破骨细胞形成、分化及活化的过程。巨噬细胞、滑膜成纤维细胞等是破骨细胞形成的主要来源，促炎因子在这个过程中起着重要作用。破骨细胞是骨侵蚀发生的重要环节，是体内唯一具有溶解骨组织能力的细胞。IL-6的过度表达会促进破骨细胞形成和分化，促进骨的重吸收[10]。与该通路有关的基因有14个，其中包括“TNF”“MAPK1”“MAPK3”“MAPK8”和“MAPK9”等。通路“MAPK signaling pathway”(hsa04010)，即MAPK信号通路。MAPK是真核细胞信号传递的重要途径之一，在调节控制细胞结构和功能活性中发挥着关键作用。MAPK信号通路在类风湿关节炎的发病机制中发挥着关键性作用，其可被细胞外信号或刺激激活，将细胞外信号逐级放大传至细胞内，调节转录因子的活性，调控相应基因的表达，进而引起细胞反应[11]。与该信号通路相关的靶点基因有“TNF”“MAPK1”“MAPK3”“MAPK8”“MAPK9”和“MAPK10”等。类风湿关节炎特征性病理改变包括关节滑膜组织炎症细胞浸润、骨关节及软骨的破坏与侵蚀，涉及的细胞包括滑膜细胞、淋巴细胞、破骨细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞等[12]。上述2条通路中都涉及到了TNF这个靶点。TNF是一种重要的免疫调节因子，在关节滑膜炎性病变及软骨基质降解中起着重要作用。TNF-α是类风湿关节炎发病的重要因子之一，其源于巨噬细胞，可促进血管内皮细胞吸附白细胞，造成炎症局部白细胞聚集，尤其是滑液中TNF-α水平异常升高可能对类风湿关节炎有一定的作用。TNF-α可影响滑膜中的各种细胞，如巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞等，诱导局部炎症和血管翳形成，导致软骨侵蚀和骨破坏[13-14]。同时，还涉及了通路“Rheumatoid arthritis”(hsa05323)，即类风湿关节炎通路，相关的基因靶点分别为“FOS”“IL17 A”“IL6”“TNF”“JUN”和“MMP1”。这与得到的相交靶点结果“AKR1B1”“ALOX5”“IL6”“JUN”“MMP1”“TNF”和“PTGS2”相比较，很容易得出“IL6”“TNF”“JUN”和“MMP1”4个靶点基因的相关性更高，且上述靶点很有可能就是针对类风湿关节炎疾病的。因此，类风湿关节炎通路尤为重要。