mCIM试验与eCIM试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能

唐克文，李娟，冯丽娜，李从荣

(武汉大学人民医院，武汉430060)

耐碳青霉烯类药物肠杆菌科细菌(CRE)的出现和传播毫无疑问是一个重要的临床和公共卫生问题。产碳青霉烯酶是CRE最重要的耐药机制之一，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)、维罗纳整合子编码-β-内酰胺酶(VIM)及亚胺培南水解β-内酰胺酶(IMP)是产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(CP-CRE)最常见的四种碳青霉烯酶，分别由blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP基因编码，其中KPC属丝氨酸类碳青霉烯酶，其余均为金属-β-内酰胺酶[1，2]。多年来，学者们一直致力于寻找碳青霉烯酶的有效检测方法。2015年，Van der Zwaluw等[3]首次描述了碳青霉烯类失活法(CIM)实验。2017年美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐在实验灭活期间将无菌水替换为胰蛋白酶大豆肉汤、延长孵育时间，有效提高了碳青霉烯酶检测的敏感度，即改良碳青霉烯类失活法(mCIM)实验。2018年，CLSI又将EDTA-碳青霉烯类失活法(eCIM)实验引入操作指南。eCIM实验原理基于金属-β-内酰胺酶必须依赖金属离子锌的存在才能有效发挥催化活性，络合剂EDTA可在细菌孵育期间络合2价锌离子，达到抑制金属-β-内酰胺酶的作用[4,5]。mCIM与eCIM联合试验可以区分产金属-β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，是一种操作简便、价格低廉、经济实用的有效表型检测方法。本研究通过mCIM试验与eCIM试验联合检测产碳青霉烯酶肠杆菌，并与基因检测结果进行比较，探讨mCIM试验与eCIM试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能。

1 材料与方法

1.1 菌株、仪器及试剂 武汉大学人民医院2016年2月～2017年2月临床住院患者标本分离的对碳青霉烯类药物(亚胺培南和/或美罗培南)敏感性降低(最小抑菌浓度≥2 μg/ml)的肠杆菌科菌株80株，其中肺炎克雷伯菌33株、大肠埃希菌19株、产气克雷伯菌10株、阴沟肠杆菌7株、产酸克雷伯菌5株、弗劳地柠檬酸杆菌3株、摩根摩根菌2株、非脱羧勒克氏菌1株。质控菌株大肠埃希菌ATCC®25922、大肠埃希菌ATCC®35218均购自卫生部临床检验中心，质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC®BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC®BAA-1706均由浙江大学邵逸夫医院俞云松教授惠赠，质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC®BAA-2146由BD公司惠赠。PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏分析仪购自美国Becton Dickinson公司，T100 PCR仪购自美国Bio-Rad公司，DYY-6C型电泳仪购自北京六一仪器厂，G:BOX Chemi XT4全自动凝胶成像分析系统购自英国SYNGENE公司，培养基购自广州迪景公司，EDTA试剂、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)购自杭州滨和微生物公司，药敏纸片(10 μg/片)购自英国OXIOD公司，2×Taq PCR Master Mix购自上海莱枫公司，PCR引物购自武汉金开瑞公司，DL1000 DNA Marker购自大连宝生物公司，Gel-Red核酸染料购自北京Biotech公司。

1.2 PCR法检测碳青霉烯酶基因 煮沸法提取细菌DNA模板，设计blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因上、下游引物并委托武汉金开瑞生物工程有限公司合成，PCR反应体系共20 μL,包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，循环32次，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统中观察。以DL1000 DNA Marker作为分子量标准，出现明亮条带且大小在预期范围判断为基因阳性[6]。

1.3 mCIM试验与eCIM试验联合应用检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型 ①mCIM试验。受检菌株80株。用1 μL接种环取一环过夜培养的新鲜纯菌落置于含2 mL TSB肉汤试管中，振荡混匀后加入一张含10 μg美罗培南的无菌纸片，35 ℃环境孵育4 h，用10 μL接种环取出美罗培南纸片，贴于已涂布大肠埃希菌ATCC®25922悬液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直径。抑菌圈直径6～15 mm或抑菌圈直径16～18 mm但抑菌圈内有针尖样菌落为mCIM试验阳性结果，抑菌圈直径≥19 mm为阴性结果，抑菌圈直径16～18 mm或抑菌圈直径≥19 mm但抑菌圈内有散在菌落为中介结果。mCIM试验阳性结果表示菌株产碳青霉烯酶。②eCIM试验。受检菌株80株。用1 μL接种环取一环与mCIM试验对应的新鲜纯菌落置于含2 mL TSB肉汤试管中，加入20 μL 0.5 mol/L的EDTA溶液，其余步骤同mCIM试验，对应菌株的mCIM与eCIM试验纸片贴于同一MH平板表面。eCIM试验结果只有当mCIM试验为阳性结果时有意义，当mCIM试验为阴性结果或中介结果时，eCIM试验结果不作解释[7]。eCIM试验结果判断标准：当eCIM试验与mCIM试验抑菌圈直径相差≥5 mm时为阳性结果，即菌株产金属-β-内酰胺酶；当eCIM试验与mCIM试验抑菌圈直径相差≤4 mm时为阴性结果，即菌株产丝氨酸碳青霉烯酶。

1.4 mCIM试验与eCIM试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能分析 以碳青霉烯酶基因检测结果为金标准，四格表法计算mCIM试验检测产碳青霉烯酶菌株的敏感性和特异性，计算eCIM试验检测产金属-β-内酰胺酶、丝氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性和特异性。敏感性=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%，特异性=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%。分析mCIM试验与eCIM试验在产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型检测中的联合应用效能。

2 结果

80株菌株中，检测出携带blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM基因的菌株分别为27株、27株、7株、1株，其中1株肺炎克雷伯菌同时携带blaNDM和blaIMP基因，1株产酸克雷伯菌同时携带blaKPC和blaNDM基因，1株产酸克雷伯菌同时携带blaNDM和blaVIM基因，即产碳青霉烯酶菌株59株。其中32株产金属-β-内酰胺酶，26株产丝氨酸碳青霉烯酶，1株同时产金属-β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶，详见表1。PCR扩增产物电泳图见图1。

表1 80株受检菌株的碳青霉烯酶基因型检测结果(株)

注：M为DL1000 DNA Marker，条带1、3、5、7为空白对照，条带2为blaKPC基因(811 bp)，条带4为blaVIM基因(370 bp)，条带6为blaIMP基因(365 bp)，条带8为blaNDM基因(281 bp)。

图1 80株受检菌株的PCR扩增产物电泳图

80株菌株中，mCIM试验阳性结果57株，阴性结果23株，即产碳青霉烯酶菌株57株。eCIM阳性结果28株，阴性结果29株，即产金属-β-内酰胺酶菌株28株，产丝氨酸碳青霉烯酶菌株29株。详见图2、表2。

注：A1为产金属-β-内酰胺酶受检菌株；A2为产金属-β-内酰胺酶对照菌株；B1为产丝氨酸碳青霉烯酶受检菌株；B2为产丝氨酸碳青霉烯酶对照菌株；C1为不产碳青霉烯酶受检菌株；C2为不产碳青霉烯酶对照菌株；D1为产碳青霉烯酶受检菌株；D2为产碳青霉烯酶对照菌株；m为mCIM试验；e为eCIM试验。

图2 部分菌株的mCIM试验与eCIM试验联合检测结果

表2 80株受检菌株的mCIM与eCIM联合试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型结果(株)

80株菌株中，59株碳青霉烯酶基因阳性菌株，其中57株试验菌株mCIM试验结果阳性，即mCIM试验检测产碳青霉烯酶菌株的敏感性为96.6%(57/59)。80株菌株中，21株碳青霉烯酶基因阴性菌株，mCIM试验结果均阴性，即mCIM试验检测产碳青霉烯酶菌株的特异性为100.0%(21/21)。

80株菌株中，33株金属-β-内酰胺酶基因(blaNDM、blaVIM、blaIMP基因)阳性，其中28株试验菌株eCIM试验结果阳性，即eCIM试验检测产金属-β-内酰胺酶菌株的敏感性为84.8%(28/33)。80株菌株中，47株金属-β-内酰胺酶基因阴性，eCIM试验结果均阴性，即eCIM试验检测产金属-β-内酰胺酶菌株的特异性为100.0%(47/47)。

80株菌株中，27株丝氨酸碳青霉烯酶基因(blaKPC基因)阳性，eCIM试验结果均阴性，即eCIM试验检测产丝氨酸碳青霉烯酶菌株的敏感性为100.0%(27/27)。80株菌株中，53株丝氨酸碳青霉烯酶基因阴性，其中51株试验菌株eCIM试验结果均阳性，即eCIM试验检测产丝氨酸碳青霉烯酶菌株的特异性为96.2%(51/53)。

3 讨论

各种类型的CRE中，CP-CRE受到最多的关注，因为它们最有可能造成细菌耐药性的整体问题。碳青霉烯酶基因携带在质粒、转座子或其他可移动遗传元件上，促进了革兰阴性菌之间抗药性的水平转移，增加了环境和临床肠杆菌科细菌的抗性储存。此外，研究[8]发现，CP-CRE中的质粒通常携带额外的抗性元件，具有增加细菌多重耐药的潜力。目前尚不建议以碳青霉烯类耐药机制指导治疗方案，且碳青霉烯类耐药机制的检测在大多数临床试验室中并非常规，但CP-CRE的感染常伴随着较高的治疗失败率及病死率，并且可能需要实施比非CP-CRE更多的感染控制干预措施，因此区分CP-CRE和非CP-CRE对于感染控制和流行病学研究十分重要[9]。Zhang等[10]的研究进行了中国首次全国范围的CRE检测，结果显示产碳青霉烯酶是中国CRE的主要耐药机制，NDM和KPC-2为主要碳青霉烯酶类型。本研究中，产金属-β-内酰胺酶菌株占产碳青霉烯酶菌株的55.9%，与相关研究结果一致。然而，迄今为止，临床常用β-内酰胺酶抑制剂如舒巴坦、克拉维酸、三唑巴坦[11]和新型抑制剂——头孢他啶-阿维吧坦，对NDM、VIM或IMP等金属-β-内酰胺酶仍然没有作用[12，13]。有效的金属-β-内酰胺酶抑制剂一方面需保证不能破坏人体金属酶，另一方面应满足对各种金属-β-内酰胺酶或同种类型金属-β-内酰胺酶起作用[14]。面对CP-CRE的感染，区分产金属-β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶可为抗生素的合理使用提供科学依据。我们认为，研发有效的金属-β-内酰胺酶抑制剂，尤其是开发靶向NDM和KPC-2的抑制剂是国内抗CRE治疗的可行策略。

通过标准药敏试验确定菌株对碳青霉烯类药物的耐药性后，额外的表型试验可以帮助确定CP-CRE，包括改良Hodge法(MHT)、Carba NP及其改良试验、CIM及其改良试验(mCIM)。另外，有研究[15]报道，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对碳青霉烯酶活性的检测。随着MALDI-TOF MS仪器在临床微生物实验室中逐渐推广应用，该方法可能会越来越受欢迎，但这些试验的目标都是针对碳青霉烯酶的产生，没有提供有关碳青霉烯酶表型的指导。本研究首先通过mCIM试验完成对产碳青霉烯酶菌株的检测，与其他试验相比，mCIM试验具有重现性好、结果易判读的优点，不仅具有较高的敏感性和特异性，且对NDM、OXA-48灵敏度更高[16～18]，随后结合eCIM试验可检测出碳青霉烯酶表型。2018年CLSI评价mCIM与eCIM联合试验检测丝氨酸碳青霉烯酶和金属-β-内酰胺酶的敏感性>95%、特异性>92%，本研究中mCIM与eCIM联合试验检测丝氨酸碳青霉烯酶的敏感性和特异性与之相符，但检测金属-β-内酰胺酶的敏感性较低。我们分析认为，一方面是本研究菌株数量有限，另一方面是eCIM试验的应用需建立在mCIM的基础上，本研究中mCIM试验出现2个假阴性结果，因此2株实际产金属-β-内酰胺酶菌株的eCIM试验结果被认为无效，这也体现出了eCIM试验的局限性，只有确定为产碳青霉烯酶菌株(mCIM试验结果阳性)时才有意义，不可单独使用。除此之外，虽然2018年CLSI推荐当mCIM试验阳性、eCIM试验阴性时菌株可报告为丝氨酸碳青霉烯酶，但eCIM试验实际只应用于金属-β-内酰胺酶的检测，所检测菌株同时携带其他碳青霉烯酶时则不能区分且可能有假阴性结果，本研究中1株同时携带blaKPC和blaNDM基因的产酸克雷伯菌eCIM试验结果既出现假阴性。

总之，mCIM与eCIM联合试验是一种操作简便、价格低廉、经济实用的有效表型检测方法。mCIM与eCIM联合试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌耐药表型的敏感性和特异性较高，对流行病学调查、感染控制和抗菌药物管理优化均具有重要意义。