东莞地区肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的表型与基因型分析

黄亚，谢树金，林偲思，朱 艳，王套瑞，吕飞，程理维，方颖，黄晓君，谢佩，陈青诗，郭主声

1.中山大学附属东莞东华医院检验科，广东 东莞 523110；

2.广东医科大学基础医学院寄生虫教研室，广东 湛江 524000；

3.广东医科大学基础医学院微生物与免疫教研室，广东 湛江 524000

碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一[1]。随着该类药物在临床的广泛应用，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年上升趋势，产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制[2]。起初所有的碳青霉烯酶都被认为是具有物种特异性和染色体编码的β-内酰胺酶。但是，在铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的质粒上分别发现了blaIMP-1[3]、blaOXA-23[4]和blaKPC-1[5]。最初，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)是在肺炎克雷伯菌中发现，随后在大肠杆菌、肠杆菌、肠沙门氏菌和非发酵菌中也有检出KPC基因的报道[6]，有研究发现KPC基因通常位于Tn4401转座子上[7-8]。这意味着碳青霉烯酶基因可通过质粒和转座子等转移元件在不同菌种间转移，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌引起的感染形势已经十分严峻。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)主要分离自尿路、肺、腹部、手术部位和血液，免疫功能低下、机械通气和高龄的患者容易感染CRE[9]。CRE的治疗取决于感染部位，分离的病原体和耐药性。由于治疗方法的复杂性和可变性，应通过体外药敏试验来制定治疗计划[9]。早期发现CRE感染有助于改善治疗并降低传播感染的可能性。碳青霉烯酶抑制剂增强试验是目前推荐度比较高的检测方法，但是存在着耗时长(过夜培养)和只能检测两种碳青霉烯酶型(A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属β-内酰胺酶)的缺点，快速便捷的检测碳青霉烯酶基因是指导临床准确用药的关键，本研究使用的赛沛GeneXpert Carba-R试剂盒可在1 h内检测5类碳青霉烯酶基因，包括blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIPM和blaOXA。本研究拟探讨结合GeneXpert Carba-R和碳青霉烯酶抑制剂增强试验快速且准确地鉴定碳青霉烯酶基因型的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株通过东莞耐药检测网收集2020年东莞地区的40株CRE菌株，剔除重复的样本。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要仪器与试剂GeneGeneXpert仪器和Carba-R试剂盒由赛沛(上海)商贸有限公司提供，VITEK 2 Compact仪器为法国生物梅里埃公司产品，药敏试验纸片和培养基购自英国OXOID公司，替加环素E-test试纸条购自，缓冲液购自上海原科实业发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的鉴定与药敏按照《全国临床检验操作规程》推荐的程序对菌种鉴定，采用VITEK 2 Compact仪器法与纸片扩散法进行药敏试验，严格按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)判读药敏，替加环素采用E-test试纸条(法国生物梅里埃公司)测定MIC值，结果判定参照美国食品与药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)。

1.2.2 碳青霉烯酶的表型检测采用碳青霉烯酶抑制剂增强试验。具体方法：使用0.9%的生理盐水将待测菌液调成0.5麦氏浊度，均匀涂布在MH琼脂平板上，然后在琼脂平板表面贴4张亚胺培南碳青霉烯抗菌药物纸片。第一张纸片不添加任何液体，第二张纸片上滴加APB溶液10μL，第三张纸片上滴加EDTA溶液10μL，第四张纸片上同时滴加APB溶液10μL和EDTA溶液10μL，过夜孵育，测量纸片抑菌圈直径，判定结果，滴加APB试剂的亚胺培南抑菌圈比亚胺培南单药的抑菌圈扩大5 mm以上，提示产A类丝氨酸碳青霉烯酶，主要为KPC型碳青霉烯酶；滴加ETDA试剂的亚胺培南抑菌圈比亚胺培南单药的抑菌圈扩大5 mm以上，提示产B类金属内酰胺酶，主要为NDM型金属酶；滴加APB试剂或ETDA试剂的亚胺培南抑菌圈比亚胺培南单药的抑菌圈直径没有明显变化，但滴加APB试剂和ETDA试剂的亚胺培南抑菌圈比亚胺培南单药的抑菌圈直径扩大5 mm以上，提示该菌同时产A类丝氨酸碳青霉烯酶与B类金属内酰胺酶。

1.2.3 碳青霉烯酶的分子检测采用GneXpert Carba-R方法检测。具体方法：用生理盐水稀释将菌液至0.5麦氏浊度，吸取10μL样品至样本处理液中，旋涡震荡10 s，吸取1.7 mL混合液加入到GeneXpert Carba-R试剂盒内，启动检测。

1.3 统计学方法采用WHONET 5.6软件对菌株分布及药敏结果进行统计分析。使用SPSS23.0软件，并采用Fisher确切概率法对CRE菌株的耐药率差异进行统计分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRE的样本分布和构成比40株CRE菌株中肺炎克雷伯菌27株(占67.50%)，大肠埃希菌10株(占25.00%)，黏质沙雷菌1株(占2.50%)，斯氏普罗威登菌1株(占2.50%)，阴沟肠杆科细菌1株(占2.50%)。

2.2 CRE菌株的标本分布CRE菌株主要来源于呼吸道标本(16株，占40%)、尿液标本(7株，占17.5%)、血液标本(4株，占10%)、分泌物标本(4株，占10%)和其他标本(9株，占22.5%)。

2.3 CRE菌株对常用抗菌药物的耐药情况40株CRE菌株的常见抗菌药物的药敏结果显示：亚胺培南的耐药率为92.5%，美罗培南的耐药率为97.5%，替加环素的耐药率较低为40.0%，见表1。

表1 CRE菌株的药敏结果

2.4 碳青霉烯酶表型检测40株CRE菌株的碳青霉烯酶型检测结果显示：有37株(92.5%)产生碳青霉烯酶，其中产A类丝氨酸碳青霉烯酶的有24株(60%)，产B类金属β内酰胺酶的有13株(32.5%)和未检出碳青霉烯酶菌株3株(7.5%)。未发现同时产A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属β-内酰胺酶的菌株。不同表型分布见表2。

表2 CRE菌株的表型分布情况

2.5 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布GeneXpert Carba-R测定法共检测出携带碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未检出blaVIM、blaIPM和bla-OXA基因，未发现检出同时拥有blaNDM和blaKPC的菌株，见表3。

表3 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布

2.6 不同碳青霉烯酶基因型的CRE菌株的药敏结果由于临床针对不同的碳青霉烯酶型采用的治疗方案不同，为了了解CRE菌株的耐药情况，本研究检测了携带blaKPC和blaNDM的CRE菌株的药敏，结果显示：CRE菌株对常用的抗生素的耐药率普遍很高，其中携带blaKPC的CRE菌株对替加环素(54.17%)的耐药率较低，携带blaNDM的CRE菌株对阿米卡星(23.07%)和替加环素(15.38%)的耐药率较低。通过Fisher精确检验，携带blaKPC的CRE菌株对阿米卡星、替加环素和氨曲南的耐药比携带blaNDM的CRE菌株的高，两者间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，对其他抗生素的耐药率两者间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表4。

表4 携带blaKPC和blaNDM的CRE菌株的药敏结果

3 讨论

按照Ambler分子分类方法，碳青霉烯酶可分为A、B和D类。A类为丝氨酸碳青霉烯酶，以blaKPC(blaKPC-2-blaKPC-55)、blaSME(blaSM E-1-blaSME-5)、blaI-MI(blaIMI-1-blaIMI-18)、blaNMC和blaGES(blaGES-1-blaGES-43)型为主；B类为金属β-内酰胺 酶，以blaNDM(blaNDM-1-blaNDM-29)、blaIMP(blaIMP-1-blaIMP-85)、blaVIM(blaVIM-1-blaVIM-69)、blaGIM(blaGIM-1-blaGIM-2)和blaSPM型为主；D类为OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶，以blaOXA-181和blaOXA-232为主[10]。除产生碳青霉烯酶外，少数菌株对碳青霉烯类药物耐药的机制是产生超广谱β内酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表达下调或缺失[10]。

我国临床分离的CRE菌株产生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型为主，少数菌株产生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[11-13]。KPC型碳青霉烯酶最主要的亚型为KPC-2型，NDM型金属酶中最主要的亚型为NDM-1和NDM-5型，OXA-48型碳青霉烯酶中最主要的亚型是OXA-181和OXA-232型酶[10]。

2005—2019年CHINET克雷伯菌属细菌耐药性监测药敏结果显示[14-15]，我国临床上分离的肺炎克雷伯菌株对碳青霉烯类抗菌药物耐药率从2005年的3%上升至2019年的25%以上，增加了8倍。2018年全国细菌耐药监测网(CARSS)数据显示，全国1429所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的平均耐药率为10.1%，部分省市甚至超过20%[16]。由于不同地区不同细菌的产碳青霉烯酶型呈现出一定的差异，并且临床针对不同碳青霉烯酶型的治疗方案也不同，所以急需实验室快速检测并鉴定碳青霉烯酶型，指导临床采取正确的治疗方案，可以及早的选择合适的抗生素，有效治疗患者的感染。

目前，实验室检测碳青霉烯酶型的方法主要分为表型检测和基因型检测。表型检测主要有改良碳青霉烯灭活试验(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制剂增强试验和Carba NP试验等，其中碳青霉烯酶抑制剂增强试验推荐度较高[10]。基因型检测方法主要包括基因检测技术和酶免疫层析技术，推荐度较高的有GeneXpert Carba-R测定法和酶免疫层析技术检测碳青霉烯酶基因[10]。受限于实验条件和检测成本，实验室常用的是碳青霉烯酶抑制剂增强试验，但是该试验耗费时间较长，而Xpert Carba-R测定法是目前较为推荐的快速检测方法，可以快速检测CRE菌株携带的碳青霉烯酶的基因型，对指导临床及时使用合适的抗生素有着重大意义[10]。

本研究结果显示，东莞地区分离的CRE菌株以肺炎克雷伯菌为主，标本主要来自呼吸道标本，对多种临床常规使用抗菌药物耐药，体外试验显示替加环素对有较好的抑菌作用。碳青霉烯酶表型检测结果显示以产A类丝氨酸碳青霉烯酶和产B类金属β内酰胺酶的CRE菌株为主，GeneXpert Carba-R测定法检测出碳青霉烯酶基因为blaNDM和blaKPC。GeneXpert Carba-R测定法共检测出携带碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未检出blaVIM、blaIPM和blaOXA基因，也未发现检出同时拥有blaNDM和blaKPC的菌株，其结果与碳青霉烯酶表型检测结果一致，其他未产碳青霉烯酶或者未检出碳青霉烯酶基因的CRE菌株，可能是高产AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶、外膜蛋白缺失和外排泵过表达等因素导致的[17]，本次研究结果显示如东莞地区CRE菌株是常见A类丝氨酸碳青霉烯酶或产B类金属β内酰胺酶的CRE菌株，表型检测和基因型检测的结果具有一致性。

相对于碳青霉烯酶抑制剂增强试验，GeneXpert Carba-R可以检测出5种碳青霉烯酶基因，比碳青霉烯酶抑制剂增强试验鉴定的碳青霉烯酶型的范围更广。此外，碳青霉烯酶抑制剂增强试验需要孵育过夜和多个步骤才能获得结果，GeneXpert Carba-R检测只需要一个小时，这意味着GeneXpert Carba-R在鉴定碳青霉烯酶基因型和根据碳青霉烯酶基因型指导临床依据基因型用药方面有着更佳的优势。本研究发现携带blaKPC和blaNDM的CRE菌株对阿米卡星、替加环素和氨曲南的耐药率有明显差别，携带blaNDM的CRE菌株对阿米卡星(23.07%)和替加环素(15.38%)的耐药率较低，另外有研究显示头孢他啶-阿维巴坦作为一种新型的抗生素，阿维巴坦本身的结构是三乙烯二胺，因为其不具有β内酰胺的骨架结构故不易被水解，对A类、C类和部分D类酶均有较好的活性[18]，但B类的金属酶没有效果[19]。建议实验室结合自身条件选择开展碳青霉烯酶抑制剂增强试验或GeneXpert Carba-R测定法检测CRE菌株，对于急症患者可通过GeneXpert Carba-R快速鉴定碳青霉烯酶的基因型，为临床提供早期治疗的参考依据，然后再通过碳青霉烯酶抑制剂增强实验确认碳青霉烯酶型，避免单一方法出现假阴性，可以为临床提供更快速且准确的鉴定结果，协助临床科室针对性的启动抗感染治疗。