miRNA-200c-3p在急性呼吸窘迫综合征中的表达及临床意义

孙建荣，党晓敏，王焕焕

1.延安大学附属医院东关分院老年呼吸科，陕西 延安 716000；

2.西安交通大学附属医院第一医院呼吸内科，陕西 西安 710061；

3.延安大学学附属医院东关分院重症医学科，陕西 延安 716000

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺内和(或)肺外多因素引起的急性进行性呼吸衰竭，患者临床多表现为呼吸频速、窘迫，顽固性低氧血症等[1]。尽管学者们对ARDS的发病机制和治疗不断探索，但数据显示在过去的10年里，ARDS的发病率及病死率并未得到显著降低，院内死亡率高达40%～60%[2]。已有相关研究指出，ARDS患者疾病严重程度与治疗反应性明显相关，根据疾病严重程度给予不同治疗措施有助于降低临床决策的失误[3-4]。因此，寻找一种能够辅助判断患者疾病发展严重程度和评价预后好坏的指标，对于观察ARDS患者治疗效果和指导下一步治疗方案，从而最终降低死亡率具有重要意义。miRNA-200c-3p通过基础实验已被验证可参与ARDS的发病机制，但是其在临床中的意义仍不清楚[5-6]。本文旨在通过相关分析研究其表达与ARDS诊断和临床指标的关系，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年7月至2020年4月延安大学附属医院东关分院重症监护室收治的118例ARDS患者作为病例组。纳入标准：①诊断标准均符合ARDS柏林标准；②临床资料完整；③年龄≥18岁。排除标准：①肺部严重疾病行肺部手术者；②有神经或精神疾病不能配合者；③有严重肝、肾、心等重要器官严重疾病者。118例ARDS患者中男性52例，女性66例；年龄18～80岁，平均(65.38±12.71)岁。所有患者随访时间为21 d，根据患者的生存状态分为存活组(n=41)和死亡组(n=77)。选取同期在我院体检的118例健康者作为对照组，其中男性55例，女性63例；年龄18～78岁，平均(64.87±12.15)岁。两组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有受检者均签署知情同意书。

1.2 研究方法收集患者的临床资料，包括性别、年龄、体质指数、SOFA评分、是否有创机械通气、是否接受CRRT、是否接受ECMO、是否糖皮质激素治疗、ARDS分型、ARDS分级和肺泡动脉氧分压差[P(A-a)O2]，其中以miRNA-200c-3p表达的中位数分为低表达组和高表达组；P(A-a)O2按照既往研究结果分为≤153 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和＞153 mmHg组[7]；将SOFA评分分为＜4分、4～6分和＞6分三组，将ARDS分型分为肺内型组和肺外型组，ARDS分级参考柏林标准依据氧合指数(oxygenation index，OI)分 为 轻 度(200 mmHg＜OI≤300 mmHg)、中 度(100 mmHg＜OI≤200 mmHg)和重度(OI＜100 mmHg)三组。

1.3 miRNA-200c-3p的检测方法分别收集5 mL病例组和健康组静脉血，室温静置1 h后，4℃、3 500 r/min离心10 min。将上层血清转移到新的收集管，4℃、16 000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，于-80℃保存。采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)从血清中提取总RNA，采用Mir-XmiRNA First-Strand Synthesis和SYBR RT-qPCR(实时荧光定量PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)逆转录生成cDNA。反应生成的cDNA模板10倍稀释后进行RT-qPCR。miRNA-200c-3p的上游引物5'-TAATACTGCCGGGTAATGATGGA-3'，下 游 引 物5'-TACTGCCGGGTAATGATGGAGGC-3'。U6的上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'。使用QuantStudioTM7 Flex RT-qPCR仪(美国ABI公司)进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃退火及延伸20 s，共40个循环。每个样品设置3个复孔，以U6为内参基因，基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.4 统计学方法应用SPSS22.0软件进行数据统计学分析。计数资料比较采用χ2检验；计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t检验；运用单因素和多因素COX回归分析研究影响病例组患者预后的独立危险因素。采用Pearson相关性分析miRNA-200c-3p与APACHEⅡ评分的相关性，并绘制相关性散点图。采用Medcalc软件绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析miRNA-200c-3p的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的miRNA-200c-3p表达水平比较病例组患者的miRNA-200c-3p相对表达量为8.17±1.17，明显高于健康组的3.22±0.89，差异有统计学意义(t=36.578，P＜0.05)。

2.2 影响ARDS预后的危险因素单因素和多因素COX回归分析结果显示，除年龄、ARDS分级和P(A-a)O2外，miRNA-200c-3p也是影响ARDS预后的独立危险因素(P＜0.05)，见表1。

表1 影响ARDS患者预后的单因素和多因素COX回归分析

2.3 miRNA-200c-3p的表达与临床指标的关系mi RNA-200c-3p表达与年龄、ARDS分型和P(A-a)O2相关(P＜0.05)，其中年龄＞60岁、ARDS分型越严重和P(A-a)O2＞183.5 mmHg显示miRNA-200c-3p的表达更高，见表2。

表2 miRNA-200c-3p表达与临床指标的关系

2.4 miRNA-200c-3p判断预后的价值根据ARDS患者预后情况，使用ROC曲线分析判断miRNA-200c-3p对预后的价值，结果显示，miRNA-200c-3p的AUC为0.847(95%CI：0.769～0.907)，特异性为86.29%，敏感性为83.63%，见图1。

图1 miRNA-200c-3p判断ARDS患者预后的ROC曲线

2.5 miRNA-200c-3p和OI水平的相关性Pearson相关分析结果显示，miRNA-200c-3p和OI水平存在明显的负相关(r=-0.753，P＜0.01)，见图2。

图2 P(A-a)O 2和OI水平的相关性离散图

3 讨论

ARDS的发病机制为肺泡组织的急性炎症反应，患者肺组织损伤导致肺换气功能障碍，肺通气/血流比例失调，肺顺应性降低，患者常因呼吸衰竭而需要接受机械通气治疗以减少肺损伤[8]。对ARDS患者病情和预后的准确评估是全面、有效、综合性治疗的前提条件，是控制病情发展、降低病死率、改善预后效果的关键。目前的研究发现，miRNA-200c-3p可通过上调核因子-κB来降低ACE2的表达，进而促进ARDS引起的急性肺损伤[5]。此外，miRNA-200c-3p还可受lncRNA的调控，进而参与急性呼吸窘迫综合征人肺上皮细胞的凋亡[6]。但是目前的文献仅停留在miRNA-200c-3p的致病机制研究上，并未从临床相关角度分析miRNA-200c-3p与ARDS的关系。因此，本文就这一方面展开研究。

本研究结果显示，miRNA-200c-3p在病例组中的相对表达量显著高于健康组。单因素和多因素COX回归分析显示，除年龄、ARDS分级和P(A-a)O2外，miRNA-200c-3p也是影响ARDS预后的独立危险因素。进一步分析发现，miRNA-200c-3p表达还与年龄、ARDS分型和P(A-a)O2相关。对于年龄＞60岁、ARDS分型越严重和P(A-a)O2＞183.5 mmHg的患者，其miRNA-200c-3p的表达更高。上述结果提示miRNA-200c-3p在ARDS患者的预后中发挥着重要作用。根据ARDS患者预后情况，使用ROC曲线分析判断miRNA-200c-3p对预后的价值，结果显示，miRNA-200c-3p的AUC=0.847(95%CI：0.769～0.907)，特异性为86.29%，敏感性为83.63%，说明miRNA-200c-3p在判断ARDS患者预后方面具有很高的价值。Pearson相关分析显示，miRNA-200c-3p和OI水平存在明显的负相关。OI是指动脉氧分压(PaO2)与吸入氧浓度(FiO2)比值的百分比，即OI=PaO2/FiO2。2012年公布的ARDS柏林定义(Berlin definition)将其作为评估患者病情严重程度和预后的有效指标[9]。若患者疾病进展，严重程度加重，则其OI水平明显下降，P(A-a)O2则逐渐增大；反之则表明治疗有效。本研究中Pearson相关分析显示miRNA-200c-3p的表达情况和OI水平存在明显的负相关(r=-0.753，P＜0.01)，提示在临床中miRNA-200c-3p的连续监测同样有助于反映患者病情变化以及预后评估。此外，P(A-a)O2是判断肺内气体交换功能异常与否、评价肺功能损伤程度的指标，主要受解剖分流情况、通气/血流比例、肺泡毛细血管弥散功能影响，与肺机能呈负相关[10-11]。P(A-a)O2＞153 mmHg患者的HR为P(A-a)O2≤153 mmHg患者的4.363倍(95%CI：3.578～5.117)，提示P(A-a)O2数值的高水平则死亡风险更高，预后更差，这与相关研究结果一致[12-14]。

综上所述，miRNA-200c-3p是影响ARDS预后的独立危险因素，密切监测miRNA-200c-3p在一定程度上可以评估患者病情严重程度和预测患者预后，具有一定的临床意义。