不同处理方式对乳中β-内酰胺酶稳定性的影响

范美婧，陈媛，蔡兴航，臧小丹，岳崇慧，孙琦，于广吉，于国萍

(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西咸阳712046）

不同处理方式对乳中β-内酰胺酶稳定性的影响

范美婧1，陈媛1，蔡兴航2，臧小丹1，岳崇慧1，孙琦1，于广吉1，于国萍1

(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西咸阳712046）

利用青霉素酶活性检测试剂盒对乳中β-内酰胺酶的稳定性进行检测，分别对乳中β-内酰胺酶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理对其稳定性影响进行了研究，从而对乳中β-内酰胺酶的稳定性进行全面的评估。结果表明，青霉素酶活性检测试剂盒检测乳中的β-内酰胺酶的最低检测限为2 U/m L。样品储存时间越长β-内酰胺酶的活性越小，并且减小程度与温度正相关。常规灭菌方法均不能使β-内酰胺酶彻底失活，酸碱处理对β-内酰胺酶有不同程度的抑制，其中碱性条件下比酸性条件下抑制作用强。

快速检测；β-内酰胺酶；乳；稳定性

0 引言

随着物质生活的极大提高，牛奶的质量安全受到人们的关注，有不法生产者在牛奶中加入生物解抗剂，为了掩盖抗生素的残留，这种解抗剂就是从微生物中提取的β-内酰胺酶[1-4]，它能对青霉素产生破坏或抑制作用。，这可使消费者对抗生素类药物耐药性增高，抵抗传染病的能力降低，给消费者的身体健康带来危害[5-7]。

现已有许多针对于β-内酰胺酶的检测方法[8-10]。而少有针对β-内酰胺酶的稳定性的相关研究，本文采用快速检测试剂盒[11]对其稳定性进行测定，根据市售牛奶制品的加工工艺及贮存方式，本实验选取保存时间、灭菌方法和酸碱处理[12-14]三个条件进行研究，根据结果对β-内酰胺酶的潜在危害性进行风险评估，为我国乳品行业卫生质量管理提供安全保障和理论支持。

1 实验

1.1材料与设备

β-内酰胺酶标准品(P0389-1 KU)，青霉素G标准品（25 g），青霉素酶活性检测试剂盒，pH计。

1.2方法

1.2.1 检测方法

北京优尼赛斯科技有限公司提供的青霉素酶活性检测试剂盒，具体操作步骤：将孵育器温度调节至40℃，取5个玻璃试剂瓶，用移液器吸取400μL样品加入到玻璃试剂瓶中，将加入样品的玻璃试剂瓶放置于孵育器上温育45 min。待温育结束后，从玻璃试剂瓶中吸取200μL待检样品置于微孔中，反复抽吸几次，使混合液均匀变成粉色。将微孔放入孵育器中温育3 min，温育结束后，将试剂条插入微孔中，继续温育3 min，温育结束后，取出试剂条，观察结果。判定方式如表1所示。

表1 判读标准

1.2.2 最低检测限的确定

将β-内酰胺酶标准品加入到牛奶样品中，配制含量分别为0.5，1，1.5，2，2.5，3，4 U/mL的样品，然后用青霉素酶活性检测试剂盒分别对其检测，确定试剂盒最低检测限。

1.2.3 贮存温度和时间对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

步骤同1.2.1，配制β-内酰胺酶终浓度分别达到2，2.5，3和4 U/mL。然后将其分别置于-18～-20，4，25和37℃无菌条件下贮藏1周，期间每1天用青霉素酶活性检测试剂盒进行检测。

1.2.4 灭菌方法对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

步骤同1.2.1，配置浓度为2，4，6，8，10，20，30，40 U/mL的β-内酰胺酶标准品的牛奶样品，分装到10 mL的试管中，如表2所示的灭菌方法[15]进行处理，再通过青霉素酶活性检测试剂盒进行检测。

表2 灭菌方法对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

1.2.5 酸碱处理对牛奶中β-内酰胺酶的影响

步骤同1.2.1，配制浓度为2，3，4，5，6 U/mL的β-内酰胺酶标准品的牛奶样品，分别装到10 mL的离心管中，用浓度为1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠溶液分别将其pH值调制至3，4，5，6，7和8。再通过青霉素酶活性检测试剂盒进行检测。

2 结果与分析

2.1青霉素酶活性检测试剂盒最低检测限的确定

用青霉素酶活性检测试剂盒分别对样品检测，结果如表3所示，当溶液浓度≥2 U/mL时，能检测出有β-内酰胺酶。所以，青霉素酶活性检测试剂盒的最低检测限为2 U/mL。

表3 β-内酰胺酶检测限的测定

2.2贮存温度和时间对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

用青霉素活性检测试剂条检测奶样，检测周期为1天1次，检测结果如表4所示。

表4 不同温度下贮存不同时间后β-内酰胺酶的稳定性

由表4可以看出，在-18～-20℃和4℃下贮存1周，各个浓度的牛奶样品都能检出β-内酰胺酶，贮存2周，仍能检出（表内未列出），说明低温贮存条件对牛奶样品中β-内酰胺酶的活性基本没有影响。在25℃下贮存1周，浓度为2.5，3，4 U/mL的牛奶样品1周内均能检出β-内酰胺酶；浓度为2 U/mL的样品，贮存6 d已无法检出。在37℃下贮存1周，浓度为3 U/mL和4 U/mL的样品，一周内均能检出β-内酰胺酶；浓度为2.5 U/mL的样品，贮存第6天时已无法检出；浓度为2 U/mL的样品，贮存第3天时已无法检出。

比较25℃和37℃条件下的牛奶样品，浓度为3 U/mL和4 U/mL的牛奶样品基本没有变化，分析低浓度2 U/mL的样品，37℃条件下的样品第3天开始就无法检出，25℃从第6天开始无法检出。随着贮存时间的增长，牛奶样品中β-内酰胺酶的活性呈下降趋势。同时说明随着贮存温度的升高，加速了β-内酰胺酶的活性减少，但没有完全失活。

2.3灭菌方法对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

用青霉素活性检测试剂条检测不同灭菌方法的牛奶样品，结果如表5所示。

表5 63，75，100和121℃下β-内酰胺酶酶活的变化

由表5可以看出，在63℃和75℃加热30 min和1 h时，当含β-内酰胺酶标准品的牛奶样品浓度为2，4，6，8 U/mL时，均未检测出β-内酰胺酶。当牛奶样品浓度为10 U/mL和20 U/mL时，均检测出β-内酰胺酶，这说明巴氏灭菌（63℃和75℃）方法对低浓度的β-内酰胺酶有一定的灭活作用，而对于高浓度的β-内酰胺酶即大于10 U/mL时，巴氏灭菌方法对β-内酰胺酶的灭活作用不明显。

在100℃加热不同时间时，当牛奶样品含β-内酰胺酶的浓度为2，4，6，8 U/mL时，均未检测出β-内酰胺酶。当牛奶样品浓度大于10 U/mL时，加热处理时间小于30 min后，均检测出β-内酰胺酶，但是从试剂条中可以发现当β-内酰胺酶浓度为10 U/mL时，第二个指示横杠颜色随着加热时间延长明显变浅，说明β-内酰胺酶的活性在较高温度随着时间的增加而有所降低。

而对于121℃条件，当浓度为10 U/mL和20 U/mL时，牛奶样品在121℃下加热处理15 s，1 min，10 min后，β-内酰胺酶被检测出，而加热30 min后，β-内酰胺酶未被检测出。将浓度增至30 U/mL和40 U/mL，在121℃下加热处理30 min后，β-内酰胺酶被检测出（结果未列出）。说明在超高温度下处理牛奶样品对β-内酰胺酶的活性影响较大。

2.4酸碱处理对牛奶中β-内酰胺酶稳定性的影响

用青霉素活性检测试剂盒检测对酸碱处理的含β-内酰胺酶标准品的牛奶样品，结果如表6所示。

表6 在不同pH值下β-内酰胺酶酶活的变化

由表6可以看出，当pH值为6和7时，所有浓度的含β-内酰胺酶标准品的牛奶样品均被检出，且被检出的最低浓度与试剂盒最低检测限相同，均为2 U/mL。当pH值为5时，青霉素酶活性检测试剂盒在β-内酰胺酶浓度为3 U/mL时才检出，牛奶样品中的β-内酰胺酶最低检测限升高，可能是酸性条件下导致β-内酰胺酶活力降低。当pH值为3和4时，青霉素酶活性检测试剂盒在β-内酰胺酶的浓度为4 U/mL时才检出，牛奶样品中的β-内酰胺酶最低检测限进一步升高，但β-内酰胺酶仍具有一定的活性。说明随着pH值的降低，β-内酰胺酶的活性有所减弱。当pH值为8时，青霉素酶活性检测试剂盒在β-内酰胺酶的浓度为5 U/mL时才检出，牛奶样品中的β-内酰胺酶活性大幅度降低，且下降速率比酸性条件快，说明酸或碱性条件均对β-内酰胺酶有破坏作用。

3 结论

本研究通过快速检测试剂盒对β-内酰胺酶的稳定性进行测定，分别对β-内酰胺酶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理进行研究。

（1）随着贮存时间的增加，β-内酰胺酶的活性减小，并且减小程度与温度成正相关。但是活性没有完全丧失，表明β-内酰胺酶在乳中有很高的稳定性。

（2）对于灭菌方法，巴氏灭菌及短时间煮沸对β-内酰胺酶无明显影响，长时间煮沸和高温对β-内酰胺酶有不同程度的灭活效果，表明β-内酰胺酶有很强的耐热性，一些灭菌方法都不能彻底的使β-内酰胺酶失活。

（3）酸碱处理对乳中β-内酰胺酶有不同程度的抑制作用，β-内酰胺酶对酸具有较强的耐受性，碱的抑制作用比酸的强，说明β-内酰胺酶在酸乳制品仍能表现出较高活性。

本研究的意义在于表明如果原料乳中含有β-内酰胺酶，以此为原料制备的牛奶制品，在生产加工后仍会有残留，尤其是低温巴氏奶，这对消费者的健康是极大的威胁，所以我们应从源头抓起，对原料乳的质量安全进行监控，从而减少β-内酰胺酶对消费者的危害。

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Effect of different treatment on the stability ofβ-lactamase in milk

FAN Meijing1,CHEN Yuan1,CAIXinghang2,ZANG Xiaodan1,YUE Conghui1,SUN Qi1, YU Guangji1,YU Guoping1
(1.College of food science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China；2.Shanxi University of Chinese Medicine,Shannxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal,Xianyang 712046，China)

The stability ofβ-lactamase in milk was detected with Penicillin activity detection kit in this study,and the effect ofthe hold time, sterilization methods and acid or alkaline environment on stability ofβ-lactamase in milk were studied respectively.A comprehensive assess⁃ment of the stability ofβ-lactamase was conducted finally.As a result,the detection limit ofβ-lactamase in milk is 2 U/mL when used the method of penicillin activity detection kit.The activity ofβ-lactamase was reduce as the hold time increase,the correlation between the de⁃crease degree of activity ofβ-lactamase and temperature was positively.The conventional sterilization methods could not completely make β-lactamase inactivated.There were different degrees of inhibition forβ-lactamase under acid or alkaline environment,wherein the inhibi⁃tion of alkaline treatmentwere stronger than thatofacid.

rapid detection;β-lactamase;stability

Q93-33

A

1001-2230（2017）04-0008-03

2016-09-13

国家科技支撑计划（2013BAD18B00）。

范美婧（1992-），女，硕士，从事食品质量与安全方面的研究。

于国萍