接受自体动静脉内瘘术的兔动静脉吻合口静脉端颈外静脉内膜厚度及自噬相关蛋白表达观察

杨雄，曾保尧，左江伟

(广西医科大学第三附属医院，南宁530031)

血液透析是终末期肾病(ESRD)患者主要的治疗与生存手段，而具有高通畅率、少并发症等优势的自体动静脉内瘘(AVF)已经成为首选血液透析通路[1,2]。但研究[3]表明，AVF在建立1年后的狭窄率仍可达40%，这也是血透患者需要进行多次手术的主要原因所在，同时也给患者与社会带来非常沉重的经济负担[4]。如何更好的解决AVF术后狭窄以建立更长久稳定的血透通路，已经成为专科医生十分棘手的难题。自噬是细胞内自我降解过程，普遍存在于大部分真核生物细胞中，可平衡细胞能量来源并调节组织稳态。在生理条件下，自噬作用会将细胞质成分汇集到自噬溶酶体中进行降解，是细胞死亡行为的替代方式，在应激条件下，还可出现自身适应性反应，维持内环境稳定。自噬在动脉粥样硬化等血管性疾病进展中有着重要作用，但自噬在AVF术后内膜增生中的表达情况目前尚不清楚。自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的表达量可以体现自噬活性的高低。Beclin-1是参与调节自噬起始阶段的重要蛋白，LC3-Ⅱ参与调节自噬体的形成，而P62作为自噬底物，在自噬过程中不断被消耗。2018年8月1日～2019年1月1日，本研究对自体动静脉内瘘术后新西兰兔吻合口静脉端颈外静脉内膜厚度及自噬相关蛋白的表达进行观察，并探讨其相关性。

1 材料与方法

1.1 新西兰兔、AVF手术方法及分组 30只雄性新西兰兔，体质量2.0～2.5 kg，由广西医科大学动物实验中心提供。将30只新西兰兔用10%水合氯醛麻醉，呈仰卧位固定在操作台上，剔除颈部兔毛、消毒、铺无菌孔巾后切开皮肤，解剖分离出左侧颈总动脉和颈外静脉，分别用两个小动脉和小静脉血管夹将动静脉的两端进行夹闭，以水平约呈30 °角剪断颈外静脉，然后用尖刀沿左侧颈总动脉长轴方向划开约5 mm开口，用肝素钠盐水冲洗干净，之后用7-0血管缝线进行端-侧吻合，用丝线结扎颈外静脉远心端，记为实验组；同时解剖分离右侧颈总动脉和颈外静脉，不予其它处理，记为对照组；最后缝合颈正中切口。分别于术后第1周(T1)、第2周(T2)、第4周(T3)时用上述同样方法麻醉及固定动物，并沿同切口切开，实验组在吻合口静脉端取一段颈外静脉，对照组在相对应位置取一段颈外静脉。将取得的静脉分成两段，一段放置于4%多聚甲醛溶液中保存备检，另一段-80 ℃保存备检。

1.2 兔颈外静脉内膜厚度测算 采用HE染色法。取4%多聚甲醛溶液中保存的颈外静脉组织，常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡，Harris氏苏木素、1%水溶性伊红染液染色，脱水、透明、风干后用中性树胶封片，显微镜下观察并测算颈外静脉内膜厚度。

1.3 兔颈外静脉Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白检测 采用Western blotting法。取-80 ℃保存的颈外静脉组织剪碎后按比例加入裂解液充分裂解，离心后收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度并将所有样品调至等浓度。每100 μL蛋白样品中加入25 μL 5倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液充分变性后，SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，Beclin-1、P62用0.45 μm的PVDF转膜1.5 h，LC3-Ⅱ用0.22 μm的PVDF转膜30 min，将PVDF膜取出，用TBST漂洗后，常温孵育1 h，用TBST漂洗后将膜正面朝下贴在一抗上，4 ℃孵育过夜，之后孵育二抗，在Oddsey扫描仪上扫描洗好的膜，用Oddsey v3.0软件对扫描结果进行分析，以荧光强度表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 兔颈外静脉内膜厚度比较 实验组T1、T2、T3时兔颈外静脉内膜厚度(见图1)分别为(28.94±2.36)、(36.71±3.64)、(67.51±6.40)μm，对照组T1、T2、T3时分别为(16.96±3.76)、(17.20±3.68)、(17.12±3.59)μm，两组同一时间点相比，P均<0.05；实验组T2、T3时的颈外静脉内膜厚度与T1时相比，P均<0.05；对照组内各时间点相比，P均>0.05。

图1 兔颈外静脉内膜厚度(HE染色，400×)

2.2 兔颈外静脉Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白相对表达量比较 结果见表1。

表1 兔颈外静脉Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白相对表达量比较

注：与对照组同一时间点相比，﹡P<0.05；与本组内T1时相比，﹟P<0.05；与本组内T2时相比，△P<0.05。

2.3 实验组兔颈外静脉内膜厚度与自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的相关性 实验组兔颈外静脉内膜厚度与Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达均呈正相关(r分别为0.887、0.919，P均<0.01)，与P62蛋白呈负相关(r=-0.788，P<0.01)。

3 讨论

研究[5]发现，AVF狭窄最主要机制是静脉内膜增生，学者们通过对人体AVF狭窄的内膜进行分析得出，在增生内膜细胞的构成当中，肌成纤维细胞为主要组成因素。Li等[6]通过对动物AVF模型分析得知，静脉内膜里的肌成纤维细胞是从外膜中的成纤维细胞转化并迁移而来。但外膜细胞如何迁移到内膜，以及成纤维细胞怎样转化为肌成纤维细胞的具体机制尚不明确，目前认为，这一转移过程与血管内皮细胞损伤、血流动力学改变、炎症及氧化应激等有着密切的关系，并且这些因素之间相辅相成，产生的众多细胞因子间构成了复杂的调节网络系统，联合推动内膜组织细胞数目的增加[7]。

自噬是溶酶体对于细胞当中已经衰老破损的蛋白质及其相关物质进行自然分解，从而保持细胞稳定的一种状态，主要有两方面的体现。其一，自噬在基础水平下对细胞内物质进行更新，维持细胞功能；其二，在外界环境改变，如氧化应激、损伤等条件下，自噬被激活上调，通过清除这些受损的细胞器以及回收可利用的产物等途径来维持细胞功能，减少损伤。如果在外界持续强烈的刺激下，可能会导致细胞出现过度自噬而发生程序性的死亡，造成细胞功能障碍，参与疾病的发展[8,9]。Beclin-1-Ⅲ型胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)是一条对自噬有着非常重要作用的调节通路，此通路表现的上增性调节能够对自噬起到推动作用[10]；LC3-Ⅰ在自噬体形成过程中能够转化为在自噬体膜的LC3-Ⅱ，提示自噬活性的程度高低与LC3-Ⅱ表达程度密不可分[11]；自噬底物P62在自噬活动中会被分解，提示自噬活性与P62表达程度呈负相关[12]。因此，自噬水平高低可通过自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ以及自噬底物P62表达程度来加以判断。

Xie等[13]在研究心肌缺血再灌注损伤中发现，心肌细胞的自噬现象在缺血缺氧的环境中被激活上调，通过增强的自噬作用可使心肌细胞免于外界损伤，最终让心梗面积减少。Karim等[14]在研究抗动脉粥样硬化中，通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路使自噬水平上调来抑制平滑肌细胞增殖。Liu等[15]在研究动物肾病模型中，通过外界干预措施使得自噬作用增加，能显著抑制系膜细胞的增殖。总而言之，当机体遭受外来刺激，细胞自噬现象增强或者通过其他途径上调自噬水平能对机体起到保护作用，延缓疾病的发展。在AVF建立后，静脉壁会长期处于高压高氧的动脉血中，造成细胞的损伤，导致细胞内环境的紊乱，为使细胞免于损伤以维护细胞功能的稳定，自噬现象能否被激活上调来发挥保护作用目前尚不确定。当前对于AVF狭窄与自噬现象的研究甚少，最近有学者[15]提出自噬参与了AVF狭窄的过程，但未能进一步阐述内膜增生与自噬之间的关系。本研究中，对照组各时间点之间对比，颈外静脉内膜厚度以及Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达均无差异，说明在未进行动静脉吻合时，无论暴露时间长短，静脉内膜细胞均无增生及自噬现象的增强。通过实验组与对照组各时间点之间进行对比，实验组各时间点的颈外静脉内膜厚度均有明显增加，提示AVF术后颈外静脉内膜出现了增生；Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白在T1、T2、T3时表达均增高，表明了AVF术后自噬现象被激活上调，而P62蛋白表达均显著下降，从而更进一步证实了AVF术后自噬水平的上升。本研究结果显示，在AVF术后同时出现了静脉内膜增生与自噬表达上调，说明了自噬参与了AVF术后内膜增生过程。进一步通过实验组各时间点之间的对比，我们发现，从第1周到第4周，静脉内膜逐步增厚，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达均呈递增趋势，P62蛋白的表达呈递减趋势，提示自噬水平逐渐增强。由此可知，在AVF术后静脉内膜增生与自噬强度呈现出正相关，即自噬活性越强，内膜增生越显著，推测自噬与静脉内膜增生存在由因及果的关系。

在内瘘建立后，如果可以通过外界干预来抑制自噬的活性的前提下，能否预防内膜增生，最终使得内瘘寿命更长久，尚无法下这样的结论。首先，本研究只是推测两者存在因果关系；其次，自噬有助于内瘘的成熟，如果对自噬干预过早，可能会更快的造成内瘘失活。在AVF形成之后，静脉壁所面对的刺激是持续的，因此可能存在过度自噬的现象，自噬反而参与介导内膜细胞进一步增生，加速内瘘狭窄的步伐。因此，想通过对自噬的调节来防治内瘘狭窄，不仅需要更进一步证实两者间的因果关系，还需要对内瘘成熟的过程和狭窄形成中的过度自噬现象等有更深的研究。

综上所述，自噬不仅参与了AVF术后静脉内膜增生的过程，并且两者表现出正相关，即自噬活性增强过程中内膜增生显著。本研究对更深入的研究自噬在AVF术后内膜增生中的作用提供一种方向和依据，也为内瘘狭窄的防治阐述了一种新思路。