EB1089对年轻初诊系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞增殖的影响及其机制

徐京京，王晓非

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110004)

系统性红斑狼疮(SLE)是以表达自身抗体为特征、多器官多系统受累为表现的自身免疫疾病，免疫功能紊乱是疾病发生发展的核心[1]。近年来SLE骨髓间充质干细胞(MSC)缺陷学说在其机制研究中是一个热门观点。免疫细胞及相关因子在输出骨髓前出现异常，或者说造血干细胞分化、发育成免疫细胞过程中出现缺陷，引起后续SLE疾病发生的连锁反应是MSC缺陷学说的依据。MSC具有自我更新的属性和多向分化的潜能，在维持骨髓微环境稳定、免疫抑制及免疫耐受等方面发挥重要作用，但SLE患者MSC可能存在基本属性缺陷，造成骨髓微环境的紊乱及造血干细胞来源的免疫前体细胞异常，减弱机体免疫抑制及调节作用，导致SLE疾病发生发展，这其中MSC增殖缺陷无疑对MSC的上述作用发挥起到限制作用[2]。研究[3]发现，MSC数量增殖减慢与微环境中活性氧(ROS)蓄积所触发的早期衰老有密切联系。维生素D及其类似物具有抗衰老、抗氧化、抑制炎症、免疫调节、细胞修复等多种药理学作用。EB1089是一种新型活性维生素D类似物，比生理活性维生素D在细胞增殖、分化等方面发挥更广泛而重要的作用。本研究观察了年轻的初诊SLE患者MSC本身是否存在增殖缺陷，然后给予EB1089进行干预，观察EB1089对MSC增殖的影响并探讨其机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年9月～2016年9月在中国医科大学附属盛京医院初次诊断为SLE的年轻患者10例，记为SLE组。SLE组10例患者均为女性，年龄(26.1±2.1)岁，病程3.6(1～9)个月，疾病活动性评分10～14分，病情评估均为中度活动。10例患者从未使用过激素、免疫抑制剂或其他控制病情药物，排除感染、肿瘤、长期慢性疾病及其他自身免疫系统疾病。同期选取年轻的体检健康者5例，记为健康组。健康组5例均为女性，年龄(26.2±1.9)岁。两组患者性别、年龄资料具有可比性。本研究获中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。

1.2 MSC细胞的分离、培养及分组 严格遵守医疗常规及操作规范，无菌条件下抽取两组患者髂后上棘骨髓液标本5 mL，肝素抗凝管收集，4 ℃保存。将骨髓液标本移至离心管中，利用加样管反复吹打形成单细胞悬液，离心后吸取上方脂肪层弃去，向管中加入淋巴细胞分离液Ficoll，分离出单个核细胞，并以5×105/mL接种于25 cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养液后，置于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，待细胞融合至80%～85%时进行传代。SLE组患者分离获得的MSC记为A组，健康组患者分离获得的MSC记为B组。

1.3 两组MSC形态观察及传代周期计算 每24～48 h利用倒置相差显微镜及其照相系统对两组MSC的生长速度及细胞形态进行观察，同时记录原代(P0代)细胞、第二代(P1代)细胞培养至融合传代所需时间。

1.4 加入不同浓度EB1089后各组MSC增殖能力观察 采用MTT噻唑蓝比色细胞增殖试验。取对数生长期的同代A、B组MSC，以1×104个接种于96孔板，分别记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4组，在含5%CO2的37 ℃培养箱中过夜培养使细胞贴壁，隔天换液，分别加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培养基100 μL干预48 h，吸上清，加入新鲜培养液90 μL及MTT溶液10 μL(5 mg/mL)，继续培养4 h，吸上清，每孔加入DMSO 100 μL，低速震荡摇晃10～15分钟，使用酶标仪在490 nm处测量各组MSC的光密度值，以光密度值表示MSC增殖能力。

1.5 加入不同浓度EB1089后各组MSC内ROS检测 分组方法同“1.4”。各组MSC分别加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培养基100 μL干预48小时，弃去培养基，PBS清洗2次，加入2 mL PBS、5 μL 2′,7′-二氯荧光素二脂(DCFH-DA，10 μmol/L)后，37 ℃培养箱孵育30 min，PBS清洗1次，用胰酶消化细胞，待细胞回缩后加入1 mL培养基终止消化，离心收集细胞，PBS清洗2次，吸入流式管，使用流式细胞仪进行检测，设置激发波长500 nm、发射波长525 nm，以荧光强度表示MSC内ROS水平。

2 结果

2.1 两组MSC形态观察及传代周期比较 两组MSC接种后均能在36 h内逐渐贴壁，早期贴壁细胞呈圆形、折光度好，部分细胞周围有光晕存在；随着培养时间延长，细胞逐渐出现分裂增生，细胞两端形成翼状突起，逐渐变为梭形或不规则多角形，形成大小不等的集落，细胞呈平行排列或涡状生长，两组MSC在形态上相似，见图1。A组P0代细胞培养至融合传代需(24.9±0.73)d，B组需(14.2±0.66)d，两组相比，P<0.05；A组P1代细胞培养至融合传代需(14.2±1.48)d，B组需(7.0±0.70)d，两组相比，P<0.05。

图1 两组MSC形态(×100)

2.2 加入不同浓度EB1089后各组MSC增殖能力比较 A1、A2、A3、A4组细胞光密度值分别为0.258±0.004、0.322±0.009、0.372±0.004、0.438±0.007，B1、B2、B3、B4组细胞光密度值分别为0.448±0.007、0.462±0.022、0.473±0.024、0.484±0.012；A1、A2、A3组与B1、B2、B3组相比，P均<0.05；A4组与B4组相比，P>0.05；A1、A2、A3、A4各浓度组内两两相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各浓度组内两两相比，P均>0.05。

2.3 加入不同浓度EB1089后各组MSC内ROS比较 A1、A2、A3、A4组ROS荧光强度分别为192.15±10.78、149.69±9.18、139.46±10.05、103.98±11.77，B1、B2、B3、B4组ROS荧光强度分别为75.76±8.34、75.30±7.95、74.61±9.81、74.26±8.46；A1、A2、A3、A4组与B1、B2、B3、B4组相比，P均<0.05；A1、A2、A3、A4各浓度组内两两相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各浓度组内两两相比，P均>0.05。

3 讨论

MSC是一类起源于中胚层、具有多向分化潜能和分泌细胞因子作用的多能基质干细胞，具有强大的免疫调节功能。近年来，在SLE相关机制研究[4]过程中，有学者发现SLE患者可能存在骨髓MSC缺陷，是一种“间充质干细胞病”。研究[5]显示，体外培养SLE骨髓MSC表现出增殖异常、迁移能力下降、传代活力与正常MSC相比明显降低，且传代过程中易衰老。研究[6]发现，SLE骨髓MSC微丝重构会导致细胞骨架形态异常，影响细胞的生命活动，还能够诱导ROS聚集、促进细胞凋亡及衰老。同时，还有研究[7]发现，SLE骨髓MSC多向分化受到抑制，自主分泌细胞因子能力异常，致病MSC移植到正常小鼠能够诱导狼疮样症状或抗核抗体产生。细胞共培养研究[8]发现，SLE骨髓MSC对T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞免疫调节和免疫平衡作用减弱，诱导免疫耐受能力下降。MSC数量缺陷对SLE骨髓MSC作用发挥无疑有重要的影响，但关于SLE骨髓MSC数量变化的研究结果不完全一致。鉴于以往研究中纳入标本多为治疗过程中的重症或难治性病例骨髓标本，不同用药方案、疾病病程长短、年龄衰老因素对研究结果均可能有一定影响，因此在本研究中收集的病例全部为年轻的初诊SLE患者，未应用糖皮质激素或免疫抑制剂及其他改善病情药物；患者年轻，避免了年龄增加带来细胞衰老的因素；患者病程相对较短，无长期病程带来慢性、远期继发性损害的风险；病情活动度相对一致，避免了不同疾病活动度对结果的稀释和中和作用。本研究发现，与B组相比，A组MSC的生长周期、倍增所需要的时间更长，增殖能力显著降低，但两组细胞在镜下基本形态无显著差异,说明SLE患者的MSC增殖能力缺陷是一种疾病自带属性，虽然无法判定其是原发遗传缺陷还是疾病发生发展中的继发产物，但这种缺陷在治疗前和疾病发生不久就已经存在了，与药物因素、疾病长病程、年龄导致的细胞退行性改变无关，但不除外上述因素可能会加重这一缺陷。

EB1089是一种新型活性维生素D类似物，除保留生理活性维生素D基本功能外，通过A环的修饰和侧链结构改造，在细胞增殖、分化方面发挥重要的药理学作用。研究[9]显示，低浓度的EB1089能够促进成纤维细胞增殖，且在浓度极低的作用下也表现出强大的促分化能力，对细胞和组织修复有一定的应用前景，而高浓度的EB1089能够干预细胞周期，对不同细胞生长有抑制作用。本研究以不同水平低浓度的EB1089干预A组的骨髓MSC，结果发现MSC数量均有明显增加，与不添加EB1089组比较差异有统计学意义，且随着药物浓度的增加，细胞数量增加更为显著，提示低浓度EB1089促增殖作用具有一定浓度依赖性。

研究[10]显示，SLE骨髓MSC的数量增殖缺陷是细胞早期衰老的一种表现，体内ROS蓄积在SLE的MSC早熟衰老过程中发挥重要作用。ROS是需氧细胞新陈代谢的产物，同时也是一种信号分子，通过核膜快速转导，调节细胞内外信号传递、基因转录、蛋白质表达过程。在外界作用或疾病本身介导下，细胞内外蛋白质重构过程、内质网过度激活反应、线粒体氧化应激及内膜呼吸链传递受阻均能够产生大量ROS或造成ROS蓄积。ROS能够改变细胞通透性，使各种细胞器、核膜等受损，也能直接触发持续的DNA损伤，或通过多条途径抑制细胞增殖，所以过量的ROS是触发DNA损伤反应的关键因素，也可能是抑制MSC增殖、诱发MSC衰老的重要原因[6]。研究[11]发现，SLE患者体内ROS的水平较健康人升高，可能与IL-1、IL-6等炎症因子的分泌激活氧化应激反应有关，也可能与SLE患者体内抗氧化酶活性减弱导致清除ROS能力下降或细胞骨架形态异常诱导ROS积聚增加所致。我们在实验中发现，A1组MSC内ROS水平显著高于B1组，进一步用不同水平低浓度的EB1089干预A组的骨髓MSC，发现细胞内ROS水平均有所下降，与EB1089未干预组相比差异具有统计学意义。随着药物作用浓度增加，细胞内ROS水平下降也更明显，提示EB1089抑制活性氧产生作用越强。EB1089具有抗氧化、抗衰老等药理活性，能双向调节衰老相关基因和蛋白表达，抑制氧化应激反应，修复DNA损伤，在老年疾病的细胞研究中有诸多证据支持。另外EB1089能够促进抗氧化酶表达，上调抗氧化系统功能，有促进ROS清除、减少蓄积的作用。我们的研究证明，EB1089能够抑制MSC内ROS水平，与EB1089干预SLE的骨髓MSC促增殖作用趋势相一致，提示EB1089促MSC增殖作用可能是通过抑制ROS水平、干扰细胞衰老过程实现的。

综上所述，初诊的年轻SLE患者骨髓MSC存在数量缺陷，与药物、疾病病程、年龄导致的细胞衰老无关。EB1089可能通过降低MSC内ROS水平、减少DNA持续损伤途径促进SLE患者骨髓MSC增殖，为维生素D类药物在SLE患者中的治疗应用提供新的理论依据。