MALBAC-NGS和array CGH检测染色体异常囊胚的结果比较

王林玉，施文韬，赵正豪，柏海燕，师娟子*

(1.西北妇女儿童医院转化医学中心，西安 710061；2.宁夏药品检验研究院，银川 750004；3.西北妇女儿童医院辅助生殖中心，西安 710003)

在自然生殖发育过程中，细胞分裂时期染色体不分离或染色单体提早分离和染色体丢失是引起染色体异常的主要原因。染色体异常分为数量异常和结构异常，数量异常更为常见[1]。目前在胚胎种植前筛查的主要技术手段就是胚胎植入前遗传学筛查或诊断(PGS/PGD)，是在胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，分析胚胎非整倍体风险的一种早期产前筛查方法，从而挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高妊娠率，降低流产率，预防出生缺陷[2-3]。PGS的有效性依赖于早期胚胎活检技术和遗传学检测分析技术。在遗传学检测分析技术方面，比较基因组杂交微阵列芯片(array CGH)是第一项广泛应用于PGS的可进行全部24条染色体筛查的技术，并已成为该领域的金标准。然而，随着科学的发展和进步，遗传学检测技术也不断推陈出新，二代测序技术(NGS)作为一项新兴的遗传学检测技术，在辅助生殖医学领域，尤其是在PGS中的应用价值备受关注[4]。检测方法的有效性对于PGS的应用前景以及临床结局至关重要。但是关于两种检测方法在PGS中的差异却鲜有报道。因此，本文拟从我院PGS病例中研究array CGH与多次退火环状循环扩增-二代测序(MALBAC-NGS)两种检测方法的差异，以期为PGS提供一个可靠的检测手段。

资料与方法

一、研究对象

收集2015年1月1日至2017年4月30日西北妇女儿童医院生殖中心行PGS的常规IVF-ET患者，以array-CGH法检测染色体异常的胚胎为研究对象，共收集32枚染色体异常的囊胚同时进行MALBAC-NGS法检测。PGS检测在西北妇女儿童医院医学遗传中心完成，采用array-CGH(BlueGnome 24SureV3软件)检测。所有进入临床PGS周期的患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1.囊胚活检：确认array CGH检测染色体异常的囊胚，玻璃化解冻复苏，放入Vitrolife G2.5培养液培养(20 μl)。培养12～24 h后，内细胞团形态明显者，再次活检内细胞团和外胚层。内细胞团活检操作技术难度较高，肉眼观察内细胞团不少于2/3被活检视为内细胞团活检成功，内细胞团活检失败或内细胞形态不明显时，整个囊胚活检。活检的细胞组织培养液洗涤后放入装有5 μl细胞裂解液的PCR管内，离心后-40℃冻存待检。

2. array CGH法检测：采用SurePlex DNA Amplification System试剂盒(购自美国New England Biolabs公司)进行全基因组扩增，然后通过array CGH方法(BlueGnome 24SureV3 package kit)对扩增后的产物进行检测，BlueFuse Multi软件分析并出具报告。

3.MALBAC-NGS法检测：采用MALBAC方法将待测样本进行全基因组扩增，向待测样本和对照品的PCR管中分别加入裂解酶，放入设定好参数的PCR仪中，裂解细胞，随后经过预扩增将微量初始模板进行线性扩增，最后经过指数扩增即完成文库构建。将构建好的文库纯化后定量，随后测序文库与引物、dNTPs、DNA聚合酶、引物载体构建“油包水”PCR反应单元后在DA8600测序平台完成NGS测序工作。检测内容为染色体非整倍体和10 M以上的片段缺失和/或重复。

三、统计学分析

实验数据以率(%)进行统计学描述，所有数据采用SPSS 23.0进行统计学分析。

结 果

一、基本数据

共活检32枚囊胚，均是经array CGH法检测为异常的囊胚，复苏培养后再次活检，通过MALBAC-NGS的方法检测胚胎染色体，MALBAC-NGS法共检测到异常囊胚17枚。两种检测方法均显示单个胚胎中一条染色体异常发生率最高(分别为43.75%、58.82%)，3条及以上染色体发生率较低(18.75%、0%)(表1、2)。在染色体缺失及重复异常中，经array CGH方法检测，9号(21.88%)、16号(21.88%)、22号(21.88%)、10号(18.75%)、13号(18.75%)及15号(18.75%)染色体发生率较高；MALBAC-NGS方法检测，13号染色体发生率最高(35.29%)(表1、3)。

表1 array CGH法和MALBAC-NGS法检测32枚胚胎检测结果展示

续表

表2 array CGH和MALBAC-NGS方法检测单个胚胎异常染色体数目的发生频率[n(%)]

表3 array CGH和MALBAC-NGS方法检测各染色体缺失/重复的发生频率[n(%)]

二、MALBAC-NGS法检测内细胞团与外胚层检测结果比较

内细胞团与外胚层分别活检的有16枚，用MALBAC-NGS法检测，其中有14枚胚胎内细胞团和外胚层检测结果完全一致，一致率达87.5%(14/16)；而另外2枚(7号、12号)胚胎内细胞团和外胚层检测结果不一致，不一致率为12.5%(2/16)(表1)。

三、两种检测方法一致性比较

经array CGH法检测为异常的胚胎，再用MALBAC-NGS法检测，其中3号、8号、9号、10号、11号、13号及14号共7枚胚胎检测结果与array CGH法检测结果完全一致，一致率达21.88%(7/32)。

四、两种检测方法检测结果比较

32枚胚胎均是经array CGH法检测异常的胚胎，活检后再用MALBAC-NGS法检测，其中15枚胚胎检测结果为正常(46，XN)，假阳性率达46.88%(15/32)(表1)。

五、两种检测方法检出嵌合率的比较

array CGH法未检出染色体嵌合的胚胎，而MALBAC-NGS法检出7号、12号及22号共3枚染色体嵌合的胚胎，染色体嵌合胚胎检出率9.38%(3/32)，染色体非嵌合胚胎检出率90.63%(29/32)。

讨 论

随着现代分子生物学的发展，运用于PGS的遗传学分析技术也在不断更新，由最初的 PCR仅能检测单位点的突变，发展到FISH技术，可以检测少数染色体，后来又出现array CGH技术，可以检测所有染色体的数目及结构异常，到目前新兴的NGS技术，可同时进行染色体异常及单基因疾病的诊断[5]。

本研究中使用MALBAC-NGS方法检测内细胞团与外胚层，两者检测结果完全一致的有14枚胚胎，一致率高达87.5%。这提示我们MALBAC-NGS方法在PGS诊断方面具有较高的可靠性和准确性。因为MALBAC-NGS从基因组扩增就采用高扩增效率、高覆盖率和均衡性、较低等位基因脱扣率的MALBAC扩增技术[6-7]，且NGS可以对全基因组进行全面地读取，随着DNA测序技术的不断成熟，其数据输出量不断增大，因此对异常的发现能力和寻找新信息的能力也不断增强。

本研究共检测32枚胚胎，均是array CGH检测异常的胚胎，活检后再用MALBAC-NGS检测，其中有7枚胚胎检测结果完全一致，另外还有5枚胚胎检测出其他异常。这提示我们MALBAC-NGS与array CGH技术有较好的一致性。有多个研究验证了NGS检测染色体非整倍体的效能。Fiorentino等[8]首次将array CGH作为参照，验证将NGS用于胚胎非整倍体检测的精确性。该研究证实了NGS是一项高通量、高度自动化的可用于染色体非整倍体筛查的技术。Yang等[9]也进行了类似试验，运用NGS技术对从38个PGS周期中获得的164例全基因组扩增产物(WGA)进行染色体非整倍体筛查，再将检测结果与之前已有的array CGH 结果进行比较。结果发现，NGS可以精确检测出所有类型的染色体非整倍体。此外，很多研究也表明MALBAC-NGS与array CGH方法具有高度的一致性[10-11]。

另外，MALBAC-NGS检出3枚染色体嵌合的胚胎，而array CGH未检测出嵌合胚胎。array CGH技术无法识别单个碱基，此外，由于分辨率不足，细胞凋亡DNA降解等原因，array CGH无法检测出小片段的染色体异常，也无法检出嵌合体胚胎。而NGS的动态范围较array CGH更加宽泛，染色体拷贝数的变化可在正常背景中清晰可见，较array CGH而言，嵌合体在NGS中也更容易识别。且大量的实验数据证明，胚胎嵌合体的存在依然使部分具有发育潜能的胚胎被排除[12-13]。因此MALBAC-NGS技术在检出嵌合率方面优于array CGH。

总之，MALBAC-NGS作为一项高通量、高度自动化的可用于染色体非整倍体筛查的技术，在诊断速度和效率、精确度、动态范围、分辨率等方面都表现出不凡的优势。因此，NGS或许可成为一种非常有价值的遗传检测分析技术，用来替代当前可用的其他染色体非整倍体筛查技术[14-15]，以期提高胚胎染色体异常的诊断效率。