长方案IVF/ICSI周期中女性年龄和获卵数对妊娠结局的影响

路红琴，何玉洁

(山西医科大学第一临床医学院生殖中心，太原 030001)

随着生育年龄的推后，环境、压力等因素的影响，我国不孕不育患者的数量已经超过400万，占育龄人口的15%。随着辅助生殖技术(ART)技术的发展，尤其是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及卵胞浆内单精子注射(ICSI)的日臻成熟，临床妊娠率及活产率得到了很大的提高。目前，对于IVF/ICSI周期妊娠结局的研究大部分集中在获卵数与临床妊娠率、新鲜周期活产率等，而一次取卵周期获卵数与累计活产率的相关性研究仍鲜见报道。本研究通过分析1 763例患者长方案获卵周期的一般情况、实验室指标及其新鲜移植活产率和累计活产率等病例资料，探讨年龄与获卵数对长方案IVF/ICSI临床结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2011年7月至2016年7月期间在本院生殖科接受IVF/ICSI助孕治疗的2 231例不孕患者的临床资料。纳入标准：(1)首次接受IVF/ICSI助孕；(2)采用GnRH-a黄体期长方案促排卵；(3)甲状腺、肾上腺等未见明显异常；(4)男方精液检查根据世界卫生组织第5版男科精液常规检查手册标准检查后可行IVF/ICSI。排除标准：(1)随访至今仍有未移植完胚胎的患者；(2)不成熟卵体外培养(IVM)、卵母细胞冻存者；(3)子宫畸形、宫腔粘连、子宫内膜异位症、剖宫产以及存在内外科合并症等；(4)囊胚移植、未获卵、未受精、无可移植胚胎以及因各种原因未行胚胎移植者，减胎术后者。

二、研究方法

1.黄体期长方案：于黄体中期使用GnRH-a(达菲林，益普生，法国)1.25～1.88 mg降调节，月经周期第2～4天行相关检查，当子宫厚度≤5 mm、血清FSH<5 U/L、黄体生成素(LH)<5 U/L、血清E2<183.5 pmol/L后开始使用促性腺激素(Gn)促排卵，经阴道超声监测卵泡生长情况，当至少有1个卵泡直径≥18 mm或2个卵泡直径≥17 mm或 3个卵泡直径≥16 mm时，当晚肌肉注射人HCG(珠海丽珠医药)6 000～10 000 U，36～38 h后在阴道超声引导下穿刺取卵。

2.胚胎培养：取卵4 h后，行IVF/ ICSI，根据Gardner 6级评分法[1]评估胚胎质量。取卵后第3天移植2～3个胚胎，未被移植的可利用胚胎于移植当日行冷冻保存。有卵巢过度刺激综合征(OHSS)风险或存在宫腔积液等不宜移植胚胎的情况时，则取消移植，冷冻所有胚胎。取卵当日开始给予黄体支持。

3.冻融胚胎移植(FET)：有冷冻胚胎者，新鲜周期失败或有再生育指标时择期行FET。采用自然周期或促排卵周期者于排卵当日开始肌肉注射黄体酮，排卵后3 d行胚胎移植；人工激素替代周期者给予雌激素促进内膜生长至8～9 mm时开始每日肌肉注射黄体酮40 mg，肌肉注射黄体酮第5天行胚胎移植。

4.移植结局随访：移植后14 d，检测血清HCG水平，若阳性为生化妊娠；移植30 d后进行超声检查，见孕囊和胎心搏动者为临床妊娠。活产定义为孕周满28周，至少有1个存活新生儿分娩。单次取卵周期移植后获得活产或移植完所有胚胎无活产为研究终点。

5.分组和评价指标：根据是否获得活产将研究对象分为活产组和非活产组；根据助孕年龄不同分为<25岁、25～29岁、30～34岁、≥35岁4组；根据获卵数不同分为≤5个、6～10个、11～15个、16～20个、≥21个5组。比较各组间的一般情况、实验室指标、妊娠结局。

新鲜移植活产率=新鲜移植分娩活婴周期数/新鲜移植周期数；累计活产率=该周期内所获胚胎行新鲜移植或FET后获得活婴周期数/取卵周期数，表示以周期为单位的累积活婴率。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料

研究共收集接受IVF助孕治疗的不孕患者2 231例，经过数据筛选及排除后共纳入研究1 763例患者(共1 763个周期)。

二、活产组与非活产组移植情况及妊娠结局的比较

1 763个取卵周期中分娩活婴的1 036个周期，累计活产率58.76%，其中新鲜移植1 438个周期，541个周期分娩活婴，新鲜移植活产率为37.62%。活产组与非活产组比较，活产组的年龄、不孕年限、基础FSH(bFSH)、Gn使用总量显著低于非活产组(P<0.05)；而HCG日血清E2水平、获卵数、卵母细胞成熟率、受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率均显著高于非活产组(P<0.05)。两组的Gn天数、HCG日内膜厚度比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

三、不同年龄组间移植情况及妊娠结局的比较

根据助孕年龄不同将入组研究对象分为<25岁(115例)、25～29岁(746例)、30～34岁(606例)、≥35岁(296例)4组。≥30岁患者的不孕年限显著高于年龄<30岁者(P<0.05)；随着年龄的增加所需Gn总量也显著增加，年龄<25岁组的受精率最低，30～34岁组的可利用胚胎率最高(P均<0.05)；≥35岁组的不孕年限和bFSH水平显著高于其他组，而≥35岁组的HCG日血清E2水平、获卵数、优质胚胎率、新鲜移植活产率及累计活产率均显著低于其他组(P均<0.05)。各年龄组间Gn天数、HCG日内膜厚度、卵母细胞成熟率的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表1 活产组与非活产组移植情况及妊娠结局比较[(-±s)，%]

注：与活产组比较，*P<0.05；aGn规格：75 U/支

表2 不同年龄组间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与<25岁组比较，*P<0.05；与25～29岁组比较，#P<0.05；与30～34岁组比较，$P<0.05

四、不同获卵数组间移植情况及妊娠结局的比较

依据获卵数不同将入组研究对象分为≤5个(160例)、6～10个(397例)、11～15个(421例)、16～20个(342例)、≥21个(443例)5组。获卵数≤5个组的年龄、所需Gn总量显著高于其他组，但HCG日血清E2水平显著低于其他组(P<0.05)；获卵数≥21个组的累计活产率显著高于其他组，差异具有统计学意义(P<0.05)。各组间不孕年限、HCG日内膜厚度、卵母细胞成熟率、受精率、可利用胚胎率及优质胚胎率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)

五、不同年龄组中不同获卵数组间移植情况及妊娠结局的比较

将不同年龄组的研究对象依据获卵数的不同进一步分组。

1.<25岁组不同获卵数组间移植情况及妊娠结局比较：获卵数≤5个组的卵母细胞成熟率显著低于其他组(P<0.05)；累计活产率随着获卵数的增加而增加，获卵数≥21个组的累计活产率最高(P<0.05)。各组间年龄、不孕年限、bFSH、Gn天数、Gn总量、HCG日内膜厚度及血清E2水平、受精率、可利用胚胎率及新鲜移植活产率的差异均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表3 不同获卵数组间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与获卵数≤5个组比较，*P<0.05；与6～10个组比较，#P<0.05；与11～15个组比较，$P<0.05；与16～20个组比较，&P<0.05

表4 <25岁组不同获卵数组间移植情况及妊娠结局比较[(-±s)，%]

注：与获卵数≤5个组比较，*P<0.05；与6～10个组比较，#P<0.05；与11～15个组比较，$P<0.05；与获卵数16～20个组比较，&P<0.05

2.25～29岁组不同获卵数组间移植情况及妊娠结局比较：获卵数≥16个两组的bFSH显著低于获卵数≤5个组(P<0.05)；获卵数≤10个两组的所需Gn总量显著高于获卵数≥16个两组，但HCG日血清E2水平显著低于获卵数≥16个组(P<0.05)；获卵数≥21个组的受精率显著低于获卵数6～10个组和获卵数16～20个组(P<0.05)；累计活产率随着获卵数的增加而增加，获卵数≥21个的累计活产率最高，与其他各组比较均有统计学差异(P<0.05)。各组间年龄、不孕年限、Gn天数、HCG日内膜厚度、卵母细胞成熟率、可利用胚胎率、优质胚胎率、新鲜移植活产率比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表5)。

表5 25～29岁组不同获卵数组间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与获卵数≤5个组比较，*P<0.05；与6～10个组比较，#P<0.05；与11～15个组比较，$P<0.05；与16～20个组比较，&P<0.05

3.30～34岁组不同获卵数间移植情况及妊娠结局的比较：获卵数≤5个组的bFSH显著高于其他组，HCG日血清E2水平随获卵数的增加而增加，≤5个组显著低于其他组(P均<0.05)；获卵数≤5个组所需Gn总量最多，获卵数≥21个组最少(P均<0.05)；获卵数6～10个组的卵母细胞成熟率显著低于获卵数≥16个两组(P<0.05)；获卵数11～15个组的新鲜移植活产率最高，显著高于其他组(P<0.05)，获卵数≥21组的新鲜移植活产率显著高于获卵数≤5个、6～10个、16～20个组(P<0.05)；累计活产率随着获卵数的增加而增加，获卵数≥21个组的累计活产率最高，显著高于其他各组(P<0.05)。各组间年龄、不孕年限、Gn天数、HCG日内膜厚度、受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率比较均无显著性差异(P>0.05)(表6)。

4.≥35岁组不同获卵数间移植情况及妊娠结局比较：获卵数≥21个组的患者年龄最小，获卵数≤5个组的bFSH、所需Gn总量均高于其他组；获卵数≤10个两组的HCG日E2水平显著低于其他组，获卵数≥21个组的卵母细胞成熟率最低，获卵数≤5个组的可利用胚胎率最高；累计活产率随着获卵数的增加而增加，获卵数≥21个组的累计活产率最高(P均<0.05)。各组间不孕年限、HCG日内膜厚度、受精率、新鲜移植活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表7)。

5.获卵数≤5个不同年龄间移植情况及妊娠结局比较：年龄≥35岁组的不孕年限显著高于25～29岁组和30～34岁组，但获卵数显著低于25～29岁组和30～34岁组；年龄≥35岁组的Gn总量显著高于其他组；年龄<25岁组的卵母细胞成熟率显著低于其他组(P均<0.05)。各组间bFSH、Gn天数、HCG日E2水平、HCG日内膜厚度、受精率、可利用胚胎率、优质胚胎率、新鲜移植活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表8)。

表6 30～34岁组不同获卵数间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与获卵数≤5个组比较，*P<0.05；与6～10个组比较，#P<0.05；与11～15个组比较，$P<0.05；与16～20个组比较，&P<0.05

表7 ≥35岁组不同获卵数间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与获卵数≤5个组比较，*P<0.05；与获卵数6～10个组比较，#P<0.05；与获卵数11～15个组比较，$P<0.0 5；与获卵数16～20个组比较，&P<0.05

表8 获卵数≤5个不同年龄间移植情况及妊娠结局的比较[(-±s)，%]

注：与<25岁组比较，*P<0.05；与25～29岁组比较，#P<0.05；与30～34岁组比较，$P<0.05

讨 论

既往对IVF/ICSI妊娠结局的评估指标很多，最常见的还是以新鲜移植妊娠率或累积妊娠率作为考量指标，但是这个指标存在很大的偏倚[2]。随着ART的发展和胚胎冷冻技术的成熟，同时为减少卵巢过度刺激综合征(OHSS)的风险和多胎妊娠的发生，单胚胎或单囊胚移植和全胚冷冻的理念逐渐被接受[3]，这增加了FET的机会，因此，包含新鲜周期及FET周期的累计活产率成为能更好地反映一次完整IVF周期成功率的指标[4-5]。

一、年龄与ART

年龄对于卵巢储备功能以及生育力的负面影响毋庸置疑，年龄越大，卵巢储备功能越差，获卵数越少，可利用胚胎以及优质胚胎数目越少，进而影响IVF妊娠成功率[6-7]。本结果显示年龄超过35岁的患者，其获卵数、优质胚胎率、新鲜移植活产率及累计活产率显著下降，可能是因为随着女性年龄的增长，卵母细胞内线粒体数量减少及功能下降，能量供应不足影响卵母细胞减数分裂；另一方面可能因为高剂量Gn的使用会干扰卵母细胞的正常减数分裂、代谢以及ATP产生，改变卵母细胞表观遗传学修饰、降低其发育潜能[8-9]。本结果还显示年龄在30～34岁患者的可利用胚胎率(58.30% vs. 55.05%)及优质胚胎率(34.84% vs. 31.28%)显著高于年龄<25岁的年轻患者。另有结果显示年龄≤25岁患者的卵母细胞利用率显著低于年龄>25岁患者，故并非大部分学者所认为的年龄越小，卵母细胞质量及胚胎质量越好，这可能是因为年龄偏小的患者在20岁初的时候仍处于卵泡快速闭锁阶段的末期，这预示着取到的部分卵母细胞可能已经启动凋亡程序，因而卵母细胞质量较差[10]。

二、获卵数与ART

表3结果显示新鲜移植活产率随着获卵数的增加而增加，但是分析表4、5、6、7不同年龄组不同获卵数比较得出，新鲜移植活产率并不随着获卵数的增加而增加。可能是因为促排卵过程中超生理剂量的促性腺激素的使用以及超生理的高雌状态，破坏卵母细胞的发育调控和同步性，导致核质成熟的不同步，降低卵母细胞的成熟率，影响妊娠结局[11-12]。另外，过高的甾体激素可以改变与着床密切相关的分子、发育基因以及子宫内膜超微结构的时序性表达，使子宫内膜组织学变化与自然周期中的生理行为不符，导致腺体发育和间质发育的同步性丧失，使种植窗的开放与胚泡的发育不同步，影响胚胎着床，最终影响妊娠结局[13-14]。另外表 6也显示30～34岁组不同获卵数组间，新鲜移植活产率在获卵数11～15个时达到最大，但累计活产率在获卵数≥21个达最高，这与Steward等[15]和Sunkara等[16]的研究结果一致，可能因为当获卵数≥21个时为预防OHSS而采取全胚冷冻的措施，而FET可能避免了卵巢高反应对子宫内膜容受性的不利影响。获卵数过少导致可移植胚胎数目减少，从而影响妊娠结局，但是获卵数过少是否同时伴胚胎质量下降目前尚未有定论。Cohen等[17]研究表明，对于卵巢反应不良的患者随着获卵数的减少同时伴随卵母细胞质量、胚胎质量的下降，增加获卵数并不能改善其妊娠结局，但Chang等[18]研究则表明，年轻卵巢低反应(poor ovarian response，POR)患者优质胚胎比例明显高于老年POR组，但低于卵巢储备正常组(P<0.01)。年轻POR患者的生化妊娠率、临床妊娠率和胚胎着床率显著高于老年POR患者。这说明年龄仍然是影响卵母细胞及胚胎质量的重要因素，对于年轻POR患者一旦获卵仍能可以取得不错的临床结局。分析表8提示，对于获卵数≤5个的患者，年龄25～29岁组的新鲜移植活产率以及累计活产率最大，与Chang等[18]研究相一致，但组间比较差异尚无统计学意义，可能与本研究样本量小有关，今后仍需大样本研究加以探讨。

三、最佳获卵数的临床探讨

获卵数过多或过少都会影响IVF/ICSI妊娠结局，是否存在一个最适获卵数范围，国内外尚无统一结论。Zhou等[19]对首次接受IVF长方案的931名的35～40岁的女性研究发现，获卵数为10～14个时，可获得最佳的累计活产率，同时OHSS风险降至最低。Devesa 等[6]分析4 570名年龄在38岁以上的不孕症妇女，在41岁之前，随着获卵数的增加，累计活产率呈上升趋势，但43岁之后获卵数的增加对累计活产率无益处。Ji等[8]对2 455名34岁以下的女性研究发现，随着获卵数的增加，累计活产率逐渐增加，但中、重度OHSS的发生率亦随之升高。获卵数6～15个时，可获得最佳的新鲜周期活产率，且累计活产率较高，OHSS发生率较低，是较为理想的获卵范围。表5、6、7显示年龄25～29岁患者，新鲜移植活产率在获卵数6～10个可达到较为满意的妊娠结局，对于30～34岁的患者，新鲜移植活产率在获卵数为11～15个时获得不错的妊娠结局，但是对于≥35岁的患者获卵数需达到16～20个才能获得较佳的妊娠结局。因此，不同年龄段最佳获卵数的范围略有差别。并且在不同年龄组均显示出累计活产率随着获卵数增加而上升的趋势，这也显现出新鲜移植活产率反映妊娠结局的局限性，故累计活产率可以更客观全面地评估一次取卵周期的妊娠结局。

四、总结

ART过程中，年龄、获卵数是与妊娠结局显著相关的因素，尤其是女性年龄≥35岁时，新鲜移植及累计活产率显著下降，且不同年龄段为达到最佳妊娠结局所需的获卵数范围不同，同时其累计活产率随着获卵数的增加而增加，所以累计活产率是评估IVF/ICSI成功率的重要指标。控制性促排卵过程中应充分评估患者的整体情况，制定个体化的促排卵方案，不仅要使患者一次取卵周期获益最大化，同时要兼顾胚胎利用率、OHSS风险等方面，避免过多剩余胚胎造成的资源浪费和潜在的伦理问题。