子宫内膜异位症患者自然周期卵泡液中细胞因子研究

吴庚香，Nick Bersinger，Michael Mueller，Michael von Wolff

(1. 武汉大学人民医院生殖医学中心，湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060；2.瑞士伯尔尼大学妇女医院妇科内分泌与生殖医学科，伯尔尼 3010)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是妇科的常见病，发病率约为5%～10%，是导致患者不孕的原因之一，但其引起不孕的机制至今尚未完全阐明。目前认为异位的内膜组织使机体发生自身免疫应答异常，引起包括盆腔和卵巢局部在内的广泛炎症反应[1]。EMs合并不孕患者卵巢储备功能下降，卵母细胞和胚胎质量下降，影响IVF临床结局[2]。本研究通过观察EMs患者自然周期卵泡液中细胞因子的成分变化，探讨EMs患者生育力低下的原因。

资料与方法

一、研究对象

募集2013～2016年间在瑞士伯尔尼大学妇女医院生殖中心因EMs行自然周期IVF-ET或卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕治疗的17例患者为研究对象(EMs组)，年龄26～42岁，平均年龄(35.7±3.7)岁。根据美国生殖医学会EMs分类修订版对患者内异症程度进行分期，I～Ⅱ期为轻度EMs组，共7例；Ⅲ～Ⅳ期为中重度EMs组，共10例。同时募集同期17例年龄匹配、因输卵管因素或男方因素在该中心行自然周期IVF/ICSI-ET助孕的患者做为对照组。所有患者3个月内均无感染性疾病及服用药物史。本研究得到了医院伦理委员会的批准，每位患者均签署了知情同意书。

二、标本收集

所有患者均采用自然周期移植，通过阴道B超及血清LH和E2浓度监测卵泡生长。当卵泡直径达到18 mm且血清E2浓度达到800 pmol/L时，当晚给予5 000 IU人绒毛膜促性腺激素(HCG，Pregnyl®，MSD，瑞士)肌肉注射，36 h后经阴道取卵。取卵时收集卵泡液，600g离心10 min，再以1 300g离心10 min，收集上清液，储存于-70℃待检测。

三、细胞因子检测

白细胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-15、IL-18，调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)，肿瘤坏死因子(TNF)-α，血管内皮生长因子(VEGF)，白血病抑制因子(LIF)等9种细胞因子使用定制的9因子试剂盒(Bio-Rad Laboratories，USA)，在Bio-Plex®平台按照试剂说明书进行检测(Bio-Rad Laboratories，USA)，卵泡液使用试剂盒中的样品稀释液按1∶3的比例进行稀释。以Bio-Plex管理软件6.1版进行原始数据转换、分析和标准曲线的计算。单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)和瘦素(Leptin)使用R&D Systems(Abingdon，英国)的Duo-Set微孔板ELISA法检测，使用含1%(w/v) 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液分别以1∶2和1∶50的比例进行稀释。

四、统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行数据的处理和统计分析，计量资料采用中位数及范围值表示，组间比较采用配对Wilcoxon检验，各细胞因子间相互关系采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、卵泡液中细胞因子浓度

IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、VEGF、MCP-1和LIF在所有患者的卵泡液标本中均可检出，而IL-15、RANTES和TNF-α仅分别能在极少部分患者的卵泡液中检出[分别为5.9%(2/34)，8.8%(3/34)和5.9%(2/34)]。其中IL-1β和IL-6在EMs患者卵泡液中的浓度显著高于对照组(中位数比较分别为0.8 pg/ml vs. 0 pg/ml和9.1 pg/ml vs. 6.1 pg/ml)，差异具有统计学意义(P<0.05)，而其他几种细胞因子浓度在两组间比较无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 采卵日卵泡液中细胞因子浓度[中位数(最小值～最大值)]

注：与对照组比较，*P<0.05

二、不同分期的EMs患者卵泡液中细胞因子浓度比较

通过对轻度及中重度EMs患者卵泡液中细胞因子浓度的比较发现，中重度EMs患者卵泡液中IL-1β浓度(1.44 pg/ml)显著高于轻度EMs及对照组(分别为0.26 pg/ml、0 pg/ml)，VEGF浓度(2 464 pg/ml)亦显著高于轻度EMs及对照组(分别为1 268 pg/ml、1 560 pg/ml)，差异具有统计学意义(P<0.05)；而IL-6、IL-8、IL-18、Leptin、MCP-1和LIF等几种细胞因子浓度在各组间无显著性差异(P>0.05)(图1)。

三、卵泡液中细胞因子浓度与EMs分期相关性关系

通过Spearman相关分析发现卵泡液中只有IL-1β和IL-6的浓度与EMs分期相关，大部分细胞因子浓度相互之间存在较强的相关性，且均为正相关，尤其是VEGF与MCP-1两种细胞因子，与所检测的其他细胞因子基本都相关；而Leptin则相反，除与VEGF相关外，与所检测的其他细胞因子均不相关(表2)。

注：与轻度EMs和对照组比较，*P<0.05图1 不同EMs分期患者卵泡液中细胞因子的表达水平

表2 EMs与卵泡液中细胞因子浓度的Spearman相关性分析(r)

注：*P<0.05，**P<0.01

讨 论

EMs被认为是一种慢性进行性炎症疾病，有研究报道在EMs患者的腹腔液和血液中某些细胞因子水平增高，如IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、VEGF等[3-6]。而卵泡液是由卵巢的颗粒细胞分泌及血液扩散而来，因此EMs疾病状态下卵泡液中的细胞因子微环境可能也会受到影响。而卵泡的生长发育、排卵以及黄体形成等过程均涉及多个细胞因子的调节[7]。卵泡液中含有多种生物活性分子和蛋白，构成排卵前卵泡生长和发育的微环境，因此卵泡液中细胞因子的改变必然会导致卵母细胞生长的微环境发生改变，进而直接影响卵母细胞完成减数分裂和受精的能力以及形成胚胎的能力[8]。EMs患者体内异常的细胞因子可能通过影响上述多个环节而导致其生殖功能障碍，导致EMs患者不孕症发生率增高、IVF妊娠结局较差。然而，既往关于EMs卵泡液的研究结果基本上都来自于常规IVF周期即超促排卵周期，在外源性促性腺激素刺激下，卵泡的激素微环境及血清中的免疫系统都会受到相应的影响[9-10]。因此这种条件下获得的卵泡液不能反映EMs疾病状态下卵泡液中真实的细胞因子变化。本研究收集的是自然周期IVF患者采卵日的卵泡液，只在扳机日使用了外源性的HCG，卵泡液受药物的影响程度已降至最低，基本可完全反映卵泡液在生理状态下的真实状态，因此自然周期IVF被认为是研究卵泡液微环境最理想的模型[9，11]。

本研究发现IL-1β和IL-6的水平在EMs患者的卵泡液中显著高于对照组(P<0.05)，且其浓度与EMs分期显著相关。IL-1β是一种可通过多种方式促进EMs发展的多效细胞因子，在EMs的形成和进展中具有重要作用[12]。EMs患者腹腔液中IL-1β浓度明显高于正常对照组[13]，深部浸润型EMs患者血清中IL-1β浓度也明显高于浅表型EMs患者及正常对照组，提示IL-1β的异常可能可以影响EMs的病理生理。Pellicer等[3]发现EMs患者的卵泡液中IL-1β浓度高于正常对照组，本研究结果与其一致，但Pellicer的结果尚无统计学意义，这可能与其样本量太小有关。IL-1β对IVF妊娠结局的影响目前还存在争议，Asimakopoulos 等[14]发现IVF周期中妊娠的患者其血清中IL-1β的浓度低于未妊娠者，但卵泡液中的IL-1β浓度却高于未妊娠者。而Zollner等[15]报道卵泡液中高浓度的IL-1β与更高的受精率相关。因此，EMs患者卵泡液中IL-1β的作用还需进一步大样本的研究探讨。

IL-6被认为是一种对卵丘细胞功能、卵冠丘复合物的扩张及卵母细胞功能具有自分泌调节功能的细胞因子[16]。有证据显示IL-6还可以直接影响卵巢功能，并对生育功能具有重要调节作用。卵泡液中IL-6水平的增高可能影响卵母细胞质量，并且可以降低卵泡中芳香化酶的活性，导致卵泡液中雌激素水平下降，进而导致生育力下降。宁艳春[17]发现EMs患者卵巢卵泡液中IL-6等细胞因子表达升高，认为这些细胞因子制造了卵母细胞生长发育的炎性微环境，使卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞生长发育情况变差，凋亡增多，分泌雌激素的功能受到影响，且体外实验发现炎性卵泡液培养微环境可降低体外未成熟卵母细胞的成熟率。Pellicer等[3]也发现EMs患者卵泡液和血清中IL-6浓度均高于正常对照组，本研究结果与其一致。

VEGF被认为是诱导血管生成的最重要、最关键的因子，在血管形成中起中心调节作用，是EMs发展的关键因子，参与EMs患者异位内膜生长并导致患者不孕。研究发现EMs组患者血清和卵泡液中VEGF水平均显著高于对照组(P<0.001)[18]，且EMs患者血清VEGF水平与EMs分期呈正相关(P<0.001)[19]。在本研究中，EMs组卵泡液中VEGF水平并未明显高于对照组，但中重度EMs患者其卵泡液中VEGF浓度显著高于轻度EMs及对照组(P<0.05)，提示VEGF的浓度与EMs严重程度相关。MCP-1是一种对单核细胞具有特异性趋化和激活活性的细胞因子，参与EMs的发生和发展。研究发现MCP-1对VEGF表达有正相调节作用，能够诱导机体内皮细胞迁移，使其参与血管生成这一生理活动，促进EMs的病理进程[20]。本研究通过细胞因子的相关性分析，发现在卵泡液中VEGF与MCP-1的浓度亦成正相关性。EMs的发病机制涉及复杂的细胞因子网络，这些细胞因子相互作用、相互影响，并参与多个细胞通路，因此彼此的变化都是密切相关的[21]。

综上所述，不论是超促排卵周期还是自然周期，EMs患者卵泡液中细胞因子微环境都发生了变化，IL-1β和IL-6的浓度均明显高于对照组，可能与EMs患者生育力降低有关。