胚胎玻璃化冷冻解冻技术对子代胚胎和胎盘中印记基因H19表达及甲基化水平的影响

马媛，陈书强，马夜肥，雷晖，文亮，王晓红

(中国人民解放军空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038)

胚胎冷冻解冻技术作为试管婴儿的必备延伸技术，自其诞生至今发展迅速[1]。人类辅助生殖技术(ART)在控制性促排卵技术(COH)下可获得多个卵母细胞，IVF后可获得多枚胚胎，新鲜周期移植后剩余胚胎进行冷冻保存以备后用。胚胎冷冻保存技术的应用及其发展进步，减少了促排卵次数和胚胎的浪费，从而增加了胚胎移植机会[2]。现有研究表明，相比于新鲜胚胎移植，胚胎玻璃化冷冻解冻移植(VET)可以改善多囊卵巢综合征(PCOS)不孕妇女的活产率[3]，但在卵巢功能正常的妇女中VET并不能增加活产率[4]。且VET可增加多囊卵巢妇女妊娠期高血压疾病的发生风险[3]。通过VET技术出生的子代平均体重高于新鲜胚胎移植子代，巨大儿的发生率高[5]。因此该技术潜在的风险仍不明确，其安全性及对子代的影响仍然需要深入研究。

表观遗传修饰在生命现象中普遍存在，是一种特殊的基因调节方式，包括DNA甲基化、乙酰化、组蛋白修饰和非编码RNA调节等。在原始生殖细胞中，双亲DNA甲基化模式消除并开始重新建立，在受精及后续的胚胎发育中不断重建及维持[6]。这个敏感时期表观遗传学改变可能导致胚胎甚至成年后的多种疾病[7]。而ART中COH、胚胎体外授精、体外培养以及胚胎冷冻及解冻均是在胚胎表观遗传学修饰的关键时期进行的，这些操作均有可能影响胚胎的表观遗传并对其发育及诞生的子代产生长远影响[8]。近年来多项研究报道了ART技术助孕的子代出现了表观遗传紊乱及疾病[9]，因此ART技术与胚胎早期表观遗传改变和子代健康成为了近年研究热点。

印记基因H19是目前表观遗传中研究比较成熟的印记基因之一，其在转录水平进行调控，主要参与胚胎的正常生长、胚胎发育及小儿行为发展[10]。有报道发现，H19的异常甲基化状态可导致Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)[11]。而银罗素综合征(SRS)患者中也发现了H19的异常低甲基化状态[12]。因此评估胚胎玻璃化冷冻是否会导致H19的表达紊乱十分重要。本研究通过建立VET的小鼠模型，收集孕9.5 d胎鼠和胎盘标本，此时期小鼠的胚胎和胎盘刚刚分化，其胎盘功能刚刚建立，相当于人类妊娠中的早期，由于胎盘早期的功能对后期胚胎及胎盘的发育至关重要，所以我们先选择了这个时间节点进行检测和分析，分析该时期胎鼠和胎盘的H19表达及甲基化状态，有助于我们探索H19对胎鼠和胎盘的不同影响及胎盘早期功能的研究分析。

材料与方法

一、实验材料

1. 实验动物：小鼠品系为ICR清洁级小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。雌鼠4～6周龄，雄鼠3～6月龄。

2. 主要试剂和仪器：胚胎冷冻解冻液体及栽杆购自日本Kitazato公司，胚胎培养采用KSOM胚胎培养液(Millipore，美国)，RNA提取采用TRIzol©Reagent(Invitrogen，美国)，反转录试剂盒和荧光聚合酶链反应试剂盒购自日本Takara公司，DNA提取采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德国)，亚硫酸氢钠修饰采用EZ DNA Methylation-GoldTM KitD5005(北京天漠)，实体解剖镜(北京Motic)，CO2培养箱(Thermo，美国)，培养皿(35 mm)(Nunc，丹麦)，超净台(Labconco，美国)，ND2000分光光度仪(Thermo，美国)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)。

二、研究方法

1.实验分组：将雌性小鼠根据处理方式的不同分为3组，分别是：自然交配组(NC)组，体外培养组(IVC)组，冻胚移植组(VET)组。每组各收集7只孕鼠。NC组：分捡发情雌鼠，与雄鼠自然合笼，次日检查阴栓，见阴栓者即为交配成功，当日记作E0.5 d。IVC组：分捡发情雌鼠，与雄鼠自然合笼，次日检查阴栓，见阴栓者当日处死雌鼠，于输卵管取受精卵，用0.3%透明质酸酶消化，然后将消化分离的受精卵多次冲洗，转入KSOM溶液中培养至囊胚后进行胚胎移植。VET组：在IVC组基础上，受精卵培养至8细胞时，进行胚胎的玻璃化冷冻及复苏，复苏后转入KSOM溶液中培养至囊胚后进行胚胎移植。

2. 胚胎玻璃化冷冻及解冻：(1)胚胎冷冻：将胚胎从培养液中转移至平衡液ES中，室温下静置5 min。随后，转入玻璃化冷冻液VS中，60 s以内将胚胎转移至做好标记的载杆上，迅速投入液氮中并盖帽保存。(2)胚胎解冻：从液氮中取出栽杆，迅速将装有胚胎的叶片前端浸入TS液中，1 min内将胚胎转移至DS中，3 min后将胚胎转移至WS1中，作用5 min，最后将胚胎移入WS2中，并将培养皿移至37℃热板上加热5 min后，转移至胚胎培养液中。

3. 胚胎移植及标本收集：小鼠胚胎移植方法参照我科既往研究[13]，每只代孕鼠左右侧宫腔各移植入8枚胚胎，共计16枚胚胎，移植当日计为E3.5 d。在3组小鼠E9.5 d脱颈处死孕鼠，计算活胎率(形态正常的胎鼠即活胎)。并收集胎鼠及胎盘组织，单个存放，投入液氮备用。

4. 实时定量PCR检测H19的表达：(1)总RNA提取：分别取3只孕鼠的6个胎鼠及胎盘组织按照试剂说明进行总RNA提取。检测总RNA质量，行后续实验；(2)cDNA合成：按照试剂说明进行cDNA合成。吸取1 μl/2 μl(1 μg/μl)总RNA为模板，反转录合成cDNA；(3)实时定量PCR：根据TaKaRa实时定量PCR试剂盒说明书配制反应体系，反应总体系为20 μl：SYBR Green 10 μl，PCR特异上、下游引物按1∶1混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，灭菌蒸馏水7 μl。扩增条件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个cycle；72℃ 2 min。以GAPDH为内参，进行PCR反应，引物序列来自Primerbank。H19引物序列：上游引物5’-CTTGTCGTAGAAGCCGTCTGTTC-3’，下游引物5’-GTAGCACCATTTCTTTCATCTTGAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物5’-TGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游引物5’-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG-3’。每次检测设定3个复孔，每个样本重复3次。在每个PCR循环的延伸期采集荧光信号，PCR反应完成后利用温度梯度变性获得溶解曲线供PCR产物定性分析。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环周期数(Cq值)，使用 2-△△Ct法计算各组中目的基因的表达水平情况。

5. 焦磷酸测序检测H19基因的甲基化水平：(1)引物设计：使用Primer Premier 5进行引物设计，共检测2个片段，6个CpG位点，H19第一片段序列：上游引物5’-TGAGTTAGGGTTGGAGAGGAA-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；H19第二个片段序列：上游引物5’-TTTGGAGTTTGGTAGGAATGTT-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；(2)DNA提取及亚硫酸氢钠修饰：按照试剂盒说明书提取单个胚胎及胎盘中的DNA样品，每组取胚胎及胎盘各8个。提取后采用ND2000分光光度计测定DNA浓度以及A260/A280，比例在1.9～2.1之间说明DNA纯度较好，标本符合测定标准后进行后续操作。亚硫酸氢钠修饰按照试剂盒进行。(3)焦磷酸测序：采用测序技术对亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA样品进行PCR产物分析，以定量位点特异性甲基化水平，该实验部分由上海生工生物工程有限公司完成，使用PyroMarkCpG software 1.0.11进行测序和分析。

三、统计学分析

结 果

一、3组孕鼠妊娠结局比较

3组孕鼠各7只，IVC和VET组中每只代孕鼠移植胚胎16枚，各组共移植112枚胚胎。NC组的平均窝仔数(10.43±2.07)显著高于IVC组的(6.43±1.51)和VET组的(6.00±1.16)(P<0.05)。比较3组孕鼠在孕9.5 d时的存活率，结果显示，IVC组和VET组的存活率分别为40.2%和37.5%，与NC组(100.0%)比较均显著性下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。IVC组与VET组两组的存活率比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组孕鼠妊娠结局比较[(-±s)，%]

注：与NC组比较，*P<0.05

二、3组孕9.5 d胚胎和胎盘组织中H19基因表达水平比较

对比3组孕9.5 d的胚胎及胎盘中H19基因表达水平，结果显示：在胚胎组织中，IVC组和VET组的H19表达水平显著高于NC组(P<0.05)，而IVC组和VET组间比较无显著性差异(P>0.05)；在胎盘组织中，3组间H19表达水平比较无显著性差异(P>0.05)(表2，图1)。

表2 三组孕9.5 d胚胎及胎盘组织中H19基因表达水平比较(-±s)

注：与NC组比较，*P<0.05

注：与NC组比较，*P<0.05图1 三组孕9.5 d的胚胎及胎盘组织中H19基因表达水平

三、3组H19基因甲基化水平的比较

检测3组孕9.5 d的胚胎和胎盘组织中H19基因的甲基化水平，结果显示：在胚胎和胎盘组织中，3组间H19基因甲基化水平比较均无显著性差异(P>0.05)。对每一个CpG位点进行分析结果显示，3组H19基因甲基化水平比较均无显著性差异(P>0.05)(表3，图2、3)。

表3 三组孕9.5 d胚胎及胎盘组织中H19基因甲基化水平比较(-±s)

A：3组胚胎组织中H19基因总体甲基化水平；B：3组胎盘组织中H19基因总体甲基化水平；C：3组胚胎组织中H19基因每个CpG位点分析；D：3组胎盘组织中H19基因每个CpG位点分析图2 三组孕9.5 d的胚胎及胎盘中H19基因甲基化水平分析

A：3组胚胎组织中H19基因总体甲基化水平；B：3组胎盘组织中H19基因总体甲基化水平图3 三组孕9.5 d胚胎及胎盘组织中H19基因甲基化水平检测示例

讨 论

早期胚胎所处环境对其影响巨大，并对后期甚至子代产生长时程影响[6]。印记基因H19是最早被发现的父源印记、母源表达的印记基因。在胚胎生长过程中，父源印记的基因倾向于保护母体，会适当抑制胚胎在子宫内的生长和发育，该印记基因的表达异常不仅可以直接对胚胎发育产生影响，而且可以通过影响胎盘的尺寸和营养代谢从而对胚胎的发育造成间接影响[10，14]。在胚胎印记重新编程的过程中，玻璃化冷冻是一种医源性应激，可造成多种表观遗传紊乱。研究发现，玻璃化冷冻解冻的小鼠卵母细胞和牛卵母细胞均出现了印记基因紊乱，并且经过玻璃化冷冻解冻的卵母细胞受精后，其形成的囊胚中发现了选择性甲基化缺失，导致印记基因表达异常[15-16]。对于2-细胞期、8-细胞期到囊胚期小鼠胚胎进行玻璃化冷冻解冻，均可降低胚胎整体DNA甲基化水平[17]。在通过冻融胚胎移植(FET)技术辅助受孕出生的新生儿胎盘中，有报道发现出现印迹基因表达异常，而这些印记基因可能与基因表达、胚胎生长发育、细胞迁移和Ⅱ型糖尿病(T2DM)的调控有关[18]。以上证据均证明，玻璃化冷冻解冻过程可能影响胚胎的表观基因组。所以需要更多的研究来了解该技术对表观遗传的影响。

本研究通过建立胚胎玻璃化冷冻解冻的小鼠模型，探索了玻璃化冷冻技术对小鼠胎盘建立早期(孕9.5 d)时胎鼠和胎盘组织中H19的表达和甲基化水平的影响。本研究发现，在孕9.5 d，IVC组及VET组的存活率显著低于NC组小鼠；在胚胎组织中，H19基因表达水平在IVC组及VET组显著高于NC组，但是在胎盘组织中并未发现H19在3组间表达的显著差异。进一步对胚胎和胎盘组织中H19基因的甲基化水平进行焦磷酸测序，结果并未发现H19的甲基化水平受到影响。

既往研究中发现，8细胞期小鼠胚胎进行玻璃化冷冻之后培养至囊胚，出现了H19表达水平的下降，而这一调控与组蛋白修饰有关[19]。但在人类第3天卵裂期胚胎经过玻璃化冷冻后，对发育至囊胚期的胚胎进行检测，其中分析了18个CpG位点，并未发现玻璃化冷冻对其产生影响[20]。2010年Wang等[21]建立小鼠模型，将玻璃化冷冻解冻后的胚胎移植入假孕受体，结果显示，相比自然妊娠小鼠，玻璃化冷冻可导致E14.5的胚胎中H19基因的表达显著增加，本研究结果与之相似，表明玻璃化冷冻组中H19基因在胎盘建立早期就已经在胚胎中出现高表达的现象；但是在E14.5的胎盘组织中，该研究发现玻璃化冷冻组出现H19表达的差异性下调，而本研究3组胎盘组织中未发现H19基因的变化。分析原因，该研究中玻璃化冷冻的胚胎是经过超促排卵、体外授精获得的，而本研究中未进行超促排卵，并且均为体内受精，既往研究中超促排卵和体外授精均可导致印记基因的紊乱，故该原因可能成为潜在的影响因素。另外，我科既往研究对自然妊娠、体外培养和体外授精的3组小鼠孕14.5 d和孕18.5 d的胎盘H19基因表达进行了研究，发现在孕14.5 d胎盘中H19基因的表达上调，而在孕18.5 d H19基因的表达下降[22]，该研究结果也提示我们H19基因在小鼠孕期的表达呈波动性，在孕9.5 d的胎盘组织我们虽然未发现H19的表达差异，但后续结果如何仍需要进一步研究探索。

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方法之一，主要修饰位点发生在DNA的CpG岛上。本研究中对H19基因的甲基化水平进行了分析，3组间未发现差异。既往研究中对H19的差异性甲基化区(DMD)的甲基化表达水平进行了分析，结果显示胚胎中H19DMD区发生了甲基化的丢失[21，23]，故该研究认为是H19DMD区域的甲基化丢失导致了H19表达水平的升高。结合既往研究，我们认为经过玻璃化冷冻解冻后，胚胎发育的不同阶段，H19表达水平均处于变化中，这些变化均与表观遗传修饰直接相关。当然，后续对H19DMD区的甲基化水平检测以及其他修饰方式如组蛋白修饰等也是我们下一个研究的重点。

由以上结果看出，胚胎的玻璃化冷冻解冻及胚胎的体外培养均可导致小鼠存活率下降，胚胎组织中H19基因的水平增高。但并未发现胎盘组织中H19基因水平的变化，且无论是胚胎组织或胎盘组织中，H19基因甲基化水平均未发现变化，后期需要更多的研究加以探索。