苦菜总黄酮超声波辅助提取及抗氧化能力研究

单科开 王鸿飞 许 凤 罗 洁 韩爱茹 李艳霞 邵兴锋 韦莹莹

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)

苦菜(Sonchus oleraceusL.)为菊科(Compositae)苦苣菜属(Sonchus)一年生或两年生草本植物,又称为苦荬菜、苣荬菜[1]。 我国苦菜资源十分丰富,主要分布在西北、华北、东北、华中地区,多生长在林下、山坡或平地田间。 苦菜作为药食同源植物[2],富含对人体有益的内酯、萜类、酚酸、多糖、氨基酸及黄酮类化合物等成分[3-5],其中黄酮类物质与苦菜的药用价值有很大的关系。 黄酮作为一种活性物质,具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、保护心脑血管系统、抗病毒及杀虫等广泛的生理活性[6]。 因此,提取并研究苦菜中的黄酮具有重要的意义。

黄酮的提取方法主要有回流提取法、微波提取法、超临界提取法、酶解法、机械力化学提取法、超声波-乙醇提取法等[7]。 而苦菜中黄酮类物质的提取方法主要有超声波法、回流提取法,翟硕莉等[8]通过超声波水提法提取苦菜黄酮,得到苦菜黄酮的提取率为2.47%；戴水平等[9]利用乙醇回流提取苦菜根中的黄酮,提取率为3.66%。 为了提高黄酮提取率并降低成本,单一提取方法越来越不能满足需求,复合法提取黄酮已成为主要趋势。 研究表明,超声波-乙醇提取法具有振动、空化、细胞破壁、热效应、超声湍流和流体边界层等综合效应,有利于植物细胞内容物向溶剂扩散,加速提取过程,从而缩短提取时间,减少溶剂用量[10-11]。 本试验以干苦菜为原料,采用超声波-乙醇提取法提取苦菜总黄酮,通过响应面法对提取工艺条件进行优化,并对苦菜总黄酮提取物的抗氧化能力进行研究,以期为苦菜总黄酮的提取及开发利用提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干苦菜购自安国药源商贸有限公司。

三吡啶三吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ],分析纯(≥99%),美国Sigma-Aldrich 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),日本和光纯药工业株式会；三羟甲基氨基甲烷(Tris Base),青岛生工生物科技有限公司；邻菲罗啉,阿法埃莎(Alfa Aesar)天津化学有限公司；芦丁标准品(质量分数≥95%)、无水乙醇、邻苯三酚、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-抗坏血酸、结晶三氯化铝,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Cary50Scan 紫外分光光度计,美国瓦里安技术中国有限公司；WK-200B 高速药物粉碎机,山东青州市精诚机械有限公司；SB3200D 超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850-R 台式高速冷冻离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦菜总黄酮的提取 参照王鸿飞等[12]的方法并略作修改。 将干苦菜粉碎,过60 目筛得苦菜干粉。精确称取1 g 苦菜干粉,加入60%乙醇溶液,超声波辅助提取(150 W,40 min),水浴浸提(60℃,60 min),经常温离心(5 000 r·min-1,15 min)后将上清液进行抽滤,滤液定容至100 mL,备用。

1.3.2 苦菜总黄酮含量的测定 采用氯化铝法[13]。精确称取0.022 4 g 芦丁标准品,用30%乙醇溶液定容至100 mL 容量瓶中,此时溶液的质量浓度为0.224 g·L-1。精密移取标准溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 比色管中,各加入1 mL 2%三氯化铝溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度,分别配置成质量浓度为0、0.004 48、0.008 96、0.011 20、0.013 44、0.017 92、0.022 40 g·L-1的芦丁标准溶液,混匀静置20 min,在270 nm 波长下测定其吸光度值。 以芦丁标准溶液的质量浓度为横坐标,以吸光度值A 为纵坐标作图,进行线性回归分析。 按照标准曲线计算苦菜中总黄酮含量,其计算公式为：

式中,y为苦菜总黄酮得率,%；m 为样品液中总黄酮的质量,g；M 为干物料的质量,g。

1.3.3 单因素试验设计 在超声功率150 W、超声时间1 h 的基础条件上,以总黄酮得率为指标,分别考察乙醇浓度、浸提温度分别设为浸提时间、料液比对苦菜总黄酮含量的影响。 其中,乙醇浓度分别设为20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提温度分别设为40、50、60、70、80、90℃；浸提时间分别设为30、60、90、120、150、180 min；料液比分别设为1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70(m/v)。

1.3.4 Box-Behnken 试验设计 单因素试验结果的基础上,以乙醇浓度(A)、浸提温度(B)、浸提时间(C)、料液比(D)为自变量,总黄酮得率(Y)为响应值,采用Box-Behnken 设计法对苦菜总黄酮的提取工艺条件进行优化。 响应面试验设计及因素水平见表1。

表1 响应面试验设计与因素水平Table1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 苦菜黄酮抗氧化能力的测定

1.3.5.1 苦菜黄酮总抗氧化能力的测定 采用FRAP 法[14]。 Fe3+还原力标准曲线的绘制：分别取浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol·L-1的FeSO4溶液各3 mL,然后加入3 mL FRAP 工作液,混匀后放置于37℃恒温水浴中反应10 min,在593 nm波长处测定吸光度值。 以FeSO4浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,进行线性回归分析。

分别取3 mL 不同质量浓度的苦菜总黄酮提取液,依次加入3 mL FRAP 工作液,混匀后于37℃条件下恒温水浴10 min,在593 nm 波长处测定其吸光度值。 苦菜黄酮总抗氧化能力以用相同吸光度值的FeSO4浓度进行表示。 以相同浓度的维生素C(Vc)作为对照。

1.3.5.2 苦菜黄酮对DPPH 自由基清除能力的测定 参照杨娜等[15]的方法。 取3 mL 一定质量浓度的苦菜总黄酮提取液,加入等体积的0.2 mmol·L-1无水乙醇溶液,混匀后在黑暗处放置30 min,以无水乙醇作为空白组,在517 nm 波长处测定其吸光度值。 以相同浓度的Vc 作对照。 按照公式计算DPPH 自由基的清除率：

式中,A0为DPPH 溶液+无水乙醇的吸光度值；A1为无水乙醇+苦菜黄酮提取液的吸光度值；A2为DPPH 溶液+苦菜黄酮提取液的吸光度值。

1.3.5.3 苦菜黄酮对羟基自由基清除能力的测定 参照Fenton 法[16]中的分光光度法。 取2 mL 一定浓度的苦菜黄酮提取物,分别加入2 mL PBS 缓冲液(pH值7.4)、2 mL 0.75 mmol·L-1邻菲罗啉无水乙醇溶液、2 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 0.01%双氧水及3 mL 蒸馏水,混合均匀后于37℃恒温水浴中反应1 h,随后迅速测定该混合溶液在536 nm 波长处的吸光度值。 以相同浓度的Vc 作对照。 按照公式计算羟基自由基的清除率：

式中,A0为PBS 缓冲液+邻菲罗啉溶液+蒸馏水+FeSO4溶液的吸光度值；A1为PBS 缓冲液+邻菲罗啉溶液+蒸馏水+FeSO4溶液+H2O2的吸光度值；A2为PBS 缓冲液+邻菲罗啉溶液+FeSO4溶液+苦菜黄酮溶液+H2O2的吸光度值。

1.3.5.4 苦菜黄酮超氧阴离子自由基清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法[17]。 邻苯三酚自氧化速率测定：4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液(pH 值8.2)于37℃水浴中预热20 min,加入4 mL 蒸馏水,均匀混合后于37℃条件下水浴20 min,随后快速加入0.5 mL 3 mmol·L-1邻苯三酚溶液(37℃水浴中预热20 min)并开始计时1 min,1 min 后迅速摇匀倒入比色皿中,以10 mmol·L-1HCl 溶液调零,于325 nm 波长处每间隔30 s 测定该溶液的吸光度值。 以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制线性回归曲线,其斜率即为邻苯三酚的自氧化速率(Ⅴ0)。

按照以上步骤,将加入4 mL 的蒸馏水替换为4 mL 不同质量浓度的苦菜黄酮溶液。 同样以10 mmol·L-1HCl 溶液调零,测定其吸光度值。 按照同样的方法进行线性回归分析,斜率记为Ⅴ1。 按照公式计算超氧阴离子自由基的清除率：

1.3.6 数据处理 使用Origin Pro 9.0、SAS 8.1 和Design Expert 8.06 软件进行数据统计分析、建立方程模型和作图。 每试验均重复3 次,取平均值。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

按照1.3.2 的方法绘制的芦丁标准曲线见图1。 其回归方程为y=34.834x+0.012 1,相关系数R2=0.998 3。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对苦菜总黄酮得率的影响 由图2可知,随着乙醇浓度的增加,苦菜总黄酮得率呈先升高后降低趋势,当乙醇浓度为50%时,苦菜总黄酮得率达到最大值(3.11%)。 乙醇浓度在较低范围内,随着乙醇浓度的增加,苦菜细胞发生溶胀现象,细胞中黄酮类化合物溶出,苦菜总黄酮得率升高[18]；当乙醇浓度继续增加,一方面,因为高浓度的乙醇在加热过程中会挥发损失而影响提取效果,另一方面,根据相似相溶的原理,高浓度的乙醇溶液会溶解细胞中色素、脂溶性等物质,从而使得总黄酮得率降低[19-20]。 因此,选择50%作为苦菜总黄酮提取的最佳乙醇浓度。

图2 乙醇浓度对苦菜总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.2 浸提温度对苦菜总黄酮得率的影响 由图3可知,随着浸提温度的升高,苦菜总黄酮得率呈先升高后降低趋势,当浸提温度为70℃时,苦菜总黄酮的得率达到最大值(3.12%)。 这是因为适当提高温度会加快分子运动,有利于苦菜黄酮的扩散和浸出,当温度继续升高时,黄酮分子结构遭到破坏,导致其提取率降低[21-22]。 故选用70℃作为苦菜总黄酮提取的最优浸提温度。

图3 浸提温度对苦菜总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.3 浸提时间对苦菜总黄酮得率的影响 由图4可知,当浸提时间为30 ～150 min 时,苦菜总黄酮得率呈上升趋势,浸提时间为150 min 时,苦菜总黄酮得率达到最大值(3.18%),浸提时间大于150 min后其得率略有下降。 这可能是因为随着浸提时间的延长,苦菜细胞壁逐渐被破坏,大量的黄酮类物质溶出,进而总黄酮得率升高[23]。 浸提时间达到150 min 时黄酮溶出已达到平衡,继续延长浸提时间会使黄酮中一些热敏性物质遭到破坏,且乙醇浓度随着浸提时间的延长而降低,导致苦菜总黄酮得率下降[24]。 因此,选用150 min 作为苦菜总黄酮提取的最佳浸提时间。

2.2.4 料液比对苦菜总黄酮得率的影响 由图5可知,不同的料液比下提取得到的苦菜总黄酮含量不同,当料液比为1 ∶60(m/v)时,苦菜总黄酮得率达到最大值(3.71%)。 这可能是由于料液比较低时,溶质和溶剂接触不充分,导致细胞中的黄酮不易溶出[25]；而过大的料液比会降低超声波的超声效果,使苦菜细胞壁不易破坏,黄酮难以溶出,而且会造成原料的浪费[26]。 因此,选择1 ∶60(m/v)作为苦菜总黄酮提取的最佳料液比。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 试验方案设计及结果 利用Design Expert 8.06 软件里的Box-Behnken 设计试验方案,其响应值及方差分析结果见表2、表3。

表2 响应面试验设计与结果Table2 Design and results of response surface experiment

表3 响应面方差分析表Table3 Variance analysis of regression equation

图5 料液比对苦菜总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

对表2数据进行分析,得到总黄酮得率(Y)和编码自变量A、B、C、D的回归方程：

Y=3.70-0.019A-0.041B+0.013C+0.13D-2.5×10-3AB+2.5×10-3AC+2.5×10-3AD+5×10-3BD+2.5×10-3CD-0.065A2-0.17B2-0.017C2-0.45D2。

由表3可知,该方程模型极显著(P＜0.000 1),且失拟项不显著(P＞0.05),说明所得方程拟合较好,回归显著[27]。 方程模型的校正相关系数R2=0.995 4,校正绝对系数=0.990 4,说明试验因素A、B、C、D对苦菜总黄酮得率影响显著。 其中B、D、A2、B2、D2的P值小于0.01,说明对苦菜总黄酮得率影响极显著；试验因素A的P值小于0.05,说明对苦菜总黄酮得率影响显著。 根据回归方程中各项系数的绝对值表示各因素对响应值影响的大小,正负表示对响应值影响的方向的原理[28],得到影响苦菜总黄酮得率的因素大小依次为：料液比(D)＞浸提温度(B)＞乙醇浓度(A)＞浸提时间(C)。

2.3.2 浸提温度与料液比交互作用对苦菜总黄酮得率的影响 在Design Expert 8.06 软件中因素的交互作用显著性是根据等高线的形状来表现的[29]。 一般等高线为椭圆形,且密集陡峭,说明因素的交互作用显著；等高线为圆形,且稀疏平滑,说明因素的交互作用不显著[30]。 由图6可知,浸提温度与料液比的等高线图陡峭,说明两者之间的交互作用显著,这与表3中结果一致,响应图中存在最高点,说明苦菜总黄酮得率存在最大值[31]。

图6 浸提温度与料液比交互作用对苦菜总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.3.3 验证试验 响应面优化得到苦菜总黄酮的最优提取工艺条件为：乙醇浓度48.66%、浸提温度68.82℃、 浸 提 时 间 162.05 min、 料 液 比1 ∶61.49(m/v),此条件下苦菜总黄酮得率的理论值为3.71%。为便于实际操作,将该条件调整为：乙醇浓度49%、浸提温度69℃、浸提时间162 min、料液比1 ∶62(m/v),经验证,此条件下苦菜总黄酮得率的实际值为3.73%±0.03%,与理论值误差仅为0.54%,证明该试验方程可靠、有效,可以用于模拟苦菜总黄酮提取工艺。

2.4 苦菜总黄酮的抗氧化活性分析

2.4.1 苦菜总黄酮提取液的Fe3+还原能力分析 由图7可知,FeSO4浓度在0.01 ～0.10 mmol·L-1范围内与吸光度值呈良好线性关系。 回归方程为y=8.164 4x-0.004 2,相关系数R2=0.999 9。

由图8可知,苦菜总黄酮提取液具有明显的总抗氧化能力。 当苦菜总黄酮提取液质量浓度为0.005 ～0.020 mg·mL-1时,其Fe3+还原能力几乎呈直线上升,当苦菜总黄酮提取液质量浓度大于0.02 mg·mL-1后,其Fe3+还原能力增大趋势变缓。 根据总抗氧化标准曲线y=8.164 4x-0.004 2 可知,0.01 mg·mL-1苦菜总黄酮提取液的抗氧化能力等同于0.18 mmol·mL-1FeSO4溶液；与相同质量浓度的Vc 溶液相比,苦菜总黄酮提取液的Fe3+还原能力较低,这与向极钎等[32]的研究结果相似。

图7 Fe3+还原力标准曲线Fig.7 The standard curve of Fe3+ reducing power

图8 苦菜总黄酮提取液对Fe3+还原力的影响Fig.8 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on Fe3+ reducing power

2.4.2 苦菜总黄酮提取液的DPPH 自由基清除能力分析 由图9可知,苦菜总黄酮提取液对清除DPPH自由基有明显作用。 当苦菜黄酮提取液质量浓度为0.001～0.01 mg·mL-1时,其DPPH 自由基清除率几乎呈直线上升；当苦菜黄酮提取液质量浓度为0.01 ～0.02 mg·mL-1时,其DPPH 自由基清除率上升趋势变缓；当苦菜黄酮提取液质量浓度大于0.02 mg·mL-1时,其DPPH 自由基清除率几乎保持不变,说明此时溶液中大多数DPPH 自由基已经被清除[33]。 与相同质量浓度的Vc 相比,质量浓度小于0.01 mg·mL-1时,苦菜黄酮提取液对DPPH 自由基表现出更强的清除能力；质量浓度大于0.01 mg·mL-1时,则Vc 对DPPH自由基表现出更强的清除能力,这与杨申明等[34]的研究结果相似。 根据拟合曲线可知,苦菜总黄酮提取液的半抑制浓度(IC50)为0.005 9 mg·mL-1。

图9 苦菜总黄酮提取液对DPPH 自由基清除率的影响Fig.9 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on DPPH radical scavenging rate

2.4.3 苦菜黄酮提取液的羟基自由基清除能力分析 由图10 可知,与相同质量浓度的Vc 相比,苦菜总黄酮提取液对羟基自由基的清除能力更强。 当苦菜总黄酮提取液的质量浓度为0.1 ～0.3 mg·mL-1时,其羟基自由基清除率上升迅速；当苦菜总黄酮提取液的质量浓度大于0.3 mg·mL-1时,其羟基自由基清除率上升变缓,说明此时溶液中的大多数羟基自由基已经被清除[35]。 根据拟合曲线得到苦菜总黄酮的IC50为0.153 mg·mL-1。

2.4.4 苦菜总黄酮提取液的超氧阴离子自由基清除能力分析 由图11 可知,与相同质量浓度的Vc 相比,苦菜总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力较弱。 苦菜总黄酮提取液的质量浓度为0.005 ～0.03 mg·mL-1时,其对超氧阴自由基的清除率逐渐上升,表现出一定的清除能力,这与白生文等[36]的研究结果相似。 根据拟合曲线得到苦菜总黄酮的IC50为0.024 8 mg·mL-1。

图10 苦菜总黄酮提取液对羟基自由基清除率的影响Fig.10 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on hydroxyl radical scavenging rate

图11 苦菜总黄酮提取液对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.11 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on superoxide anion radical scavenging rate

3 讨论

植物细胞壁是植物有效成分提取的主要阻碍,只有将封闭目标产物的细胞壁破坏掉,目标产物流出,才能提高有效成分的提取率[37]。 超声波辅助提取技术因其操作简便、经济省时等优点已被广泛应用于提取植物黄酮类物质。 夏宁等[38]采用水溶法提取荷叶总黄酮,通过优化得到荷叶总黄酮最佳得率为2.49%,而丁芳林等[39]采用超声波辅助法提取荷叶总黄酮,通过正交优化得到荷叶总黄酮最佳提取率为4.4%。 本试验结果表明,在优化后的工艺条件下,苦菜总黄酮理论得率为 3.71%,高于权美平[6]的试验结果(1.96%),但比张晶晶等[19]的试验结果(6.64%)低。以上除了工艺条件的差异,还可能与原料本身差异有关,不同地区的苦菜由于生长环境不同,导致其本身黄酮类物质含量不同[40],此外,原料颗粒的大小也影响总黄酮的提取效果。

研究表明,在人体正常代谢下自由基有一定的免疫和传递信号的功能,但过量的自由基会严重影响人的身体健康,引发多种疾病,如心脏病、老年痴呆症等,因此降低自由基对人体危害已势在必行[41]。 黄酮类物质具有清除自由基的能力,本试验中,苦菜总黄酮提取液具备DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力,其中苦菜总黄酮提取液对DPPH 自由基的清除能力与张坤等[42]的试验结果相似,但表现出更强的DPPH 自由清除基能力,这可能是因为苦菜中含有较多的酚酸[2]；在清除羟基自由基能力上,本试验结果与周劝娥等[43]的研究结果有差异,这可能是因为不同浓度的乙醇提取溶剂,导致苦菜总黄酮中成分的不同,且苦菜总黄酮提取液中含有单宁、多酚类等抗氧化物质,相互间产生协同效应,从而提高了对羟基自由基的清除能力；在清除超氧阴离子自由基能力上,与周劝娥等[43]的研究结果相比,本试验中苦菜总黄酮提取液对超氧阴离子自由基表现出更强的清除能力。在总抗氧化能力(Fe3+还原力)上,本研究结果与张坤等[42]的试验结果相似,说明苦菜总黄酮提取液表现出一定的总抗氧化能力。

4 结论

采用超声波-乙醇法提取苦菜总黄酮,利用响应面法得到苦菜总黄酮的最优提取条件为：乙醇浓度49%、浸提温度69℃、浸提时间162 min、料液比1 ∶62(m/v),此条件下苦菜总黄酮得率为3.73%±0.03%,较单因素得率有相应的提高,说明采用响应面法优化工艺可靠。 苦菜总黄酮提取液具有较强的抗氧化活性,在清除羟基自由基能力上,苦菜总黄酮较同质量浓度Vc 表现出更强的清除能力,这为苦菜总黄酮的开发和应用提供了科学依据。 但本试验中苦菜总黄酮为粗提液,含有许多杂质,所以下一步可对苦菜总黄酮提取液进一步分离纯化并对其成分进行分析,深入探究苦菜总黄酮的抗氧化功效。