刺葡萄愈伤组织UFGT基因克隆及表达分析

赖呈纯 潘 红 黄贤贵 范丽华 赖钟雄 段长青 刘文慧

(1福建省农业科学院农业工程技术研究所,福建 福州 350003；2福建省农产品(食品)加工重点实验室,福建 福州 350003；3福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建 福州 350002；4中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083；5北京汇源食品饮料有限公司,北京 101305)

植物花青素生物合成需要一系列的结构基因和转录因子协同作用[1-2],其中类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶( UDP-glucose：flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UFGT)是该合成途径最后一个关键的结构基因编码的蛋白[3],该酶可催化华翠素(delphinidin)、杨梅素(myricetin)、槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)等进行糖基化,形成稳定的花青素苷,进而使植物呈现不同的颜色[4]。 因此,UFGT 对植物花[5]、果[6-8]、茎[9]和叶[10]色泽的形成以及植物细胞中花青素苷的累积有重要的调控作用[11-12]。

不稳定花青素转变成稳定花青素苷的糖基化过程中,大多数植物花青素的糖基化发生在C3 羟基上,仅有小部分糖基化发生在C5 上,因此,催化花青素糖基化作用的酶有2 个类型,一个是3-O-糖基转移酶(UDP-glucose：flavonoid 3-O-glycosyltransferase,3GT)[1,13-14],也称UFGT,另一个为5-O-糖基转移酶( UDP-glucose：anthocyanin 5-O-glucosyltransferase,5GT)[15-17]。 研究表明,UFGT 所催化的步骤是整个花青素生物合成途径的关键点,在葡萄果实花青素的累积中起着至关重要的作用[18-19],如对不同颜色葡萄品种的研究发现,UFGT基因仅在红色葡萄品种转色开始后的果皮和红皮红肉品种的果肉中表达,而在白色品种的果皮和果肉中均不表达,而其他与花青素合成相关的结构基因在红皮品种或白皮品种中均有一定量的表达[20-22]；在葡萄细胞培养中也发现,可以通过促进或抑制UFGT基因表达来调控细胞中花青素的累积[23-24]。 但前人对UFGT基因的研究主要集中在其对葡萄果实中花青素生物合成的作用[25-26],而对于细胞水平,尤其是不同细胞系及细胞连续培养的不同阶段UFGT基因的表达调控模式尚鲜见报道。

本研究在已成功诱导并长期继代保持了2 个刺葡萄愈伤组织细胞系的基础上[27],利用该体系进行花青素合成调控研究。 从刺葡萄愈伤组织中分离编码UFGT 蛋白的基因,并利用生物信息学的分析方法,对该基因结构、编码蛋白的理化性质和高级结构进行预测和解析,同时分析2 个刺葡萄愈伤组织细胞系中UFGT基因转录水平差异,以及其在愈伤组织培养过程中不同阶段的表达变化,以期为从细胞水平揭示UFGT基因的功能及其调控花青素合成的机理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以福建省农产品(食品)加工重点实验室诱导并长期继代保持的2 个同质不同型的刺葡萄愈伤组织细胞系DLR 和DLW 为试验材料[27]。 DLR 细胞系稳定呈紫红色(图1-A),具有极强的花青素和原花青素合成能力；DLW 细胞系稳定呈浅黄绿色(图1-B),无花青素和原花青素合成能力。 刺葡萄愈伤组织继代培养20 d 后,挑取生长状态良好的愈伤组织,转接至新的继代培养基中,培养至第10 天开始取样,之后每隔5 d取样,直至培养取样至第60 天,共取样11 次,每细胞系设3 次生物学重复。 培养物收集后立即用液氮速冻,-80℃保存备用。 培养室温度为23±1℃,光照强度为3 000～4 000 lx,相对湿度为50%～60%,光周期为10 h 光照/14 h 黑暗。 以培养25 d 的DLR 愈伤组织为基因克隆材料。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA 和基因组DNA 提取 按照植物RNA提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)的说明书,提取刺葡萄愈伤组织25 d 培养物的总RNA,并按照SuperScript® ⅢFirst-Strand Synthesis System 试剂盒(Invitrogen,USA)说明书反转录成cDNA 第一链,参照邢桂春等[28]的RACE 技术合成基因的3′端和5′端模板,用于基因cDNA 全长克隆,接头引物详见表1。 按照DNA 提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]说明书提取25 d 培养物的基因组DNA,用于基因DNA 序列克隆。 2 个愈伤组织的11 个阶段细胞培养物提取总RNA,并稀释成相同浓度后,反转录成cDNA第一链,作为实时荧光定量PCR 的模板。 设3 次生物学重复。

1.2.2 刺葡萄UFGT基因的分离克隆 根据刺葡萄愈伤组织转录组数据[27]所获得的刺葡萄UFGT基因片段,设计上下游引物,以cDNA 第一链为模板,进行PCR 扩增。 采用25 μL 反应体系：Premix Taq (包括1.25 U Ex Taq、0.4 mmol·L-1dNTP、4 mmol·L-1Mg2+)12.5 μL,cDNA 模板(20 ng·μL-1) 1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,加无菌ddH2O 补足至25 μL。PCR 反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸80 s,共35 个循环；72℃延伸10 min。 根据上述克隆测序获得的UFGT基因片段设计3′端和5′端引物,并按上述反应体系和反应程序克隆获得UFGT基因的3′端和5′端序列。 根据拼接获得的UFGT基因cDNA 全长序列,设计UFGT基因开放阅读框引物,用于UFGT基因cDNA 全长克隆验证和DNA序列克隆,反应体系与上述相同,反应程序除退火温度为60℃外,也与上述程序一致。 基因克隆所用引物详见表1。 上述所有PCR 扩增产物均经过1.5%琼脂糖凝胶电泳,并回收目的条带,连接pMD18-T 载体并送至铂尚生物技术(上海)有限公司测序,获得所扩增目的条带序列。

1.2.3VdUFGT基因及其编码氨基酸序列的生物信息学分析 利用Nucleotide Blast 在线分析VdUFGT基因的同源性关系。 通过DNAMAN 8.0 软件推测出VdUFGT基因编码蛋白的氨基酸序列,并利用在线分析 工 具 ProtParam ( http：/ /web.expasy.org/protparam/)、 TMpred ( http：/ /www.ch.embnet.org/software/TMPRED _ form.html)、 SignalP 4.1 Server(http：/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NCBI 的CDD (http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)等预测VdUFGT基因推导的蛋白序列的理化性质、结构、功能等。GOR4(https：/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_gor4.html)预测VdUFGT 蛋白二级结构；SWISS-MODEL(http：/ /swissmodel.expasy.org/interactive)预测VdUFGT 蛋白的三级结构。VdUFGT基因编码蛋白的多重序列比对采用MEGA 7.0 软件[29],并通过邻近法构建系统发育树,Bootstrap 值设置为1 000。

1.2.4 基因转录水平的分析 利用NCBI 的Primer-BLAST (http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/)设计特异性引物用于RT-qPCR(表1),同时以经筛选获得的表达稳定性好的基因为内参[30],不同愈伤组织细胞系以β-Tubulin、EF1-α为内参基因；不同培养阶段以SAND、VAG为内参基因(表1)。 以不同细胞系、不同培养阶段的刺葡萄愈伤组织cDNA 为模板,在Light Cycler® 480II System (Roche)系统进行RTqPCR 反应,采用20 μL 反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、cDNA(5 ng·μL-1)模板2 μL,加灭菌ddH2O补足至20 μL。 PCR 反应程序：95℃预变性10 s；95℃变性5 s,60℃退火20 s,共40 个循环；融解曲线分析从60℃15 s,上升至95℃(每秒上升0.1℃)。 每个样品均设3 次生物学重复。 采用2-ΔΔCt法[31]分析基因相对表达量。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010 软件进行数据处理和分析基因相对表达量分析,利用DPS 软件进行差异显著性分析。

表1 本研究所用引物序列Table1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 刺葡萄UFGT 基因全长序列的克隆与分析

利用转录组UFGT基因片段设计的上下游引物进行扩增,测序得到了837 bp 的碱基序列片段(图2-A),经Nucleotide Blast 比对分析,其与山葡萄、欧洲葡萄、圆叶葡萄、美洲葡萄等的UFGT基因碱基序列相似性均达到98%以上,表明该片段为刺葡萄的UFGT基因,并将其命名为VdUFGT,GeneBank 登录号为KY986282。 通过对VdUFGT基因的RACE 扩增,获得该基因的3′端碱基序列为728 bp(图2-B),与上述VdUFGT基因片段完全重叠的有653 bp,含有TAG 终止密码子；获得该基因5′端碱基序列为971 bp(图2-C),与上述VdUFGT基因片段完全重叠的有535 bp,且含有ATG 起始密码子。 拼接获得带有5′-UTR和poly A 尾的全长序列为1 469 bp,并利用DNAMAN 8.0 软件预测VdUFGT基因的开放阅读框(open reading flame,ORF)并设计ORF 引物,经PCR 扩增TA克隆,获得该基因的cDNA 及DNA 的ORF 全长序列,分别为1 371 bp(图2-D) 和1 448 bp(图2-E)。VdUFGT基因DNA 序列包含2 个外显子和1 个内含子,2 个外显子长度分别为487 bp 和884 bp,内含子长度为77 bp。

图2 刺葡萄愈伤组织VdUFGT 基因克隆Fig.2 Cloning of VdUFGT in callus of spine grape

2.2 刺葡萄VdUFGT 基因编码蛋白理化性质与结构的预测分析

在线软件ProtParam 分析表明,VdUFGT基因编码456 个氨基酸,预测分子式C2255H3503N605O648S19,原子总数为7 030 个,分子量约为50.1 kD,理论pI 为6.03,说明其为酸性蛋白；该蛋白由20 种氨基酸组成,缬氨酸含量最丰富,为9.2%,其他氨基酸含量介于1.1%～9.0%之间,不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸,负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)总电荷为48,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)总电荷数42,亲水性平均系数-0.008,不稳定系数40.68,推测是一个带负电荷的不稳定亲水性蛋白。 在线蛋白跨膜区软件TMpred 预测表明,VdUFGT 蛋白存在阀值超过500 的4 个由内而外的和3 个由外而内的跨膜区域；SignalP 4.1 Server软件分析表明,该蛋白不具有典型的信号肽切割位点,预测VdUFGT 蛋白为膜结合蛋白。

GOR4 预测分析表明,VdUFGT 蛋白的多肽链中,α-螺旋(alpha helix,h)占34.65%,延伸链(extended strand,e)占17.32%,而不规则卷曲(random coil,c)占48.03%,是最大的结构元件(图3-A)。 NCBI 的CDD分析表明,VdUFGT 蛋白具有一个UDPGT 结构域,是UDPGT 超家族(superfamily)成员,具有UDP-黄酮糖基转移酶glycosyltransferase YjiC 特征区域(图3-B)。SWISS-MODEL 预测VdUFGT 蛋白的三级结构(图3-C),分析显示VdUFGT 蛋白的空间结构构象较为复杂,可能与其功能相关。

2.3 UFGT 同源基因编码蛋白的物种间系统进化分析

将刺葡萄VdUFGT基因编码蛋白的氨基酸序列通过NCBI 的BlastP 进行序列比对,比对结果选取排名靠前的25 个植物的UFGT同源基因蛋白的氨基酸序列,利用Mega 7.0 软件构建系统发育树。 由图4可知,UFGT同源基因编码蛋白所构建的进化关系,与植物进化的关系相一致,分成两大分支,拟南芥和醉蝶花同在一个大的分支中,其他23 个植物在另一个大分支中,并按照科或属进一步分类；其中,6 个葡萄属植物,包括刺葡萄(Vitis davidii)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、欧洲葡萄(Vitis vinifera)、欧美杂种葡萄(Vitis labrusca×Vitis vinifera)、山葡萄(Vitis amurensis)在同一个分支中,本试验克隆获得的刺葡萄VdUFGT基因编码的蛋白处在该分支的上端,表明刺葡萄在进化上可能属于较原始的类型。

图3 刺葡萄VdUFGT 蛋白氨基酸序列的结构预测分析Fig.3 The structure prediction of amino acid sequence of VdUFGT protein

2.4 刺葡萄VdUFGT 基因的表达分析

2.4.1 2 个细胞系中VdUFGT基因的转录水平分析 前期研究发现DLR 和DLW 2 个愈伤组织细胞系合成花青素和原花青素的能力存在较大差异,DLR 细胞系具有很强的花青素和原花青素合成能力,而DLW细胞系没有花青素和原花青素合成能力[27]。 由图5可知,2 个细胞系VdUFGT基因相对表达量在不同培养时间均存在极显著差异,培养25 d 和35 d DLR 细胞系VdUFGT基因的表达量分别较DLW 高79 倍和14 倍以上,表明DLR 细胞系和DLW 细胞系花青素和原花青素合成能力的差异,在VdUFGT基因的转录水平上得到了充分体现。 进一步说明VdUFGT基因在刺葡萄细胞中花青素合成中具有重要作用,其表达变化是与其功能相适应的。

2.4.2 刺葡萄愈伤组织不同培养阶段VdUFGT基因的相对表达变化趋势 RT-qPCR 检测结果表明,在DLR 愈伤组织培养过程中,VdUFGT基因表达水平变化幅度大且较复杂,有2 个明显的表达峰值,分别出现在刺葡萄愈伤组织快速生长的中期和衰老的初期,具体的变化趋势为10～15 d 表达水平较低,15 ～20 d 时表达水平快速上调,20～25 d 表达水平急剧增加,到25 d 时达到整个培养过程的最高值,且显著高于其他培养时间,之后急剧下调,30～45 d 表达水平变化较为平缓,45～50 d 时又快速上调,形成第2 个高峰,50 d 时相对表达量为2.34,50 d 后又快速下调,55 ～60 d 表达水平略为上调。 DLR 愈伤组织有极强的花青素和原花青素合成能力,VdUFGT 是其合成代谢途径中的关键酶,其复杂的变化趋势,可能与其行使的功能相适应。 DLW 愈伤组织细胞系几乎不合成花青素和原花青素,与此相适应的是VdUFGT表达水平虽然也呈现起伏变化,培养过程部分阶段表达量也存在显著性差异,但其与DLR 相比变化幅度不大,整个培养过程其相对表达量维持在0.48 ～1.68 之间(图6)。

3 讨论

葡萄果实中花青素的含量是葡萄外观品质的重要指标,也决定了其加工品质[32-33]。 近年来随着人们对葡萄多酚类物质(包括花青素)关注,大量的研究者对葡萄果实花青素生物合成进行了相关研究[34-35]。 葡萄果实中花青素的生物合成代谢途径受一系列结构基因和转录因子催化和调控[3,32],在这些结构基因中,UFGT基因编码的酶在花青素合成代谢最后阶段起关键的催化作用,将花青素糖基化,形成稳定的花青素苷,从而显示不同的色泽[4]。 研究表明,UFGT基因在葡萄花青素生物合成中的表达存在品种特异性,如在红高葡萄芽变株系中UFGT转录水平较高,导致果皮中花青素含量增加[26]；刺葡萄转录组分析发现,UFGT基因在黑色品种中高水平表达,而在白色刺葡萄品种中不表达[22]。 本研究结果表明,VdUFGT基因在红色刺葡萄愈伤组织中表达水平极高,而在白色刺葡萄愈伤组织中仅有微量表达,这与前人研究一致,但由于红色愈伤组织和白色愈伤组织均来源于同一刺葡萄的幼胚,其VdUFGT基因的表达模式可能与葡萄品种间UFGT差异表达的模式有一定的差异。 此外,本研究的白色刺葡萄愈伤组织VdUFGT基因有转录,只是转录水平极低,与前人白色葡萄品种检测不到UFGT基因转录的结论不一致[21-22],这种差异是否存在新的机制还有待进一步研究。

图4 UFGT 同源基因编码蛋白的系统进化分析Fig.4 Phylogenetic tree of proteins encoding from UFGT homologous genes

图5 不同刺葡萄愈伤组织细胞系中VdUFGT 的表达分析Fig.5 Expression of VdUFGT in different cell lines of spine grape callus

图6 刺葡萄愈伤组织不同培养阶段VdUFGT 的表达分析Fig.6 Expression of VdUFGT at different culture stages during the culture of spine grape callus

葡萄果实发育是一个复杂的过程,尤其是其进入葡萄浆果着色成熟期,是葡萄果实色泽形成的关键时期[36]。 研究表明,葡萄中UFGT基因受诸多理化因子的调控,如葡萄细胞培养过程中,培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)可以促进UFGT的表达,使花青素含量增加[23],而添加eutypine 会抑制UFGT基因转录,从而使细胞中花青素累积量下降[33]；脱落酸能强化UFGT的表达而加速葡萄果实转色[37-38]；夜间光照处理可改变UFGT的表达而显著影响葡萄果皮花青素苷的生物合成[39]；有机质能促进UFGT基因表达而提高葡萄果皮花色苷含量[40]；果胶寡糖能使UGFT持续高水平表达从而增加葡萄果皮花青素的含量[41]；蔗糖可作为信号分子促进UFGT基因的表达,增加葡萄果皮中花青素含量[42]。本研究发现,转接后的刺葡萄红色愈伤组织会褪色,且随后愈伤组织基本处于无色状态,培养15 d 后颜色才开始慢慢出现,培养20 d 后愈伤组织颜色持续加深,25 d 后愈伤组织颜色快速加深,这种变化情况与其VdUFGT基因转录水平的变化趋势基本一致,表明可通过外源理化因子的作用来提高刺葡萄细胞中花青素的含量。 此外,本研究还发现,刺葡萄愈伤组织培养45～55 d 时,VdUFGT基因转录水平出现突然升高又迅速下降的现象,这可能是因为细胞进入衰老初期,有一个类似氧化胁迫的过程,推测其是一种抵御衰老氧化胁迫的机制,但准确的结论还需进一步研究。

4 结论

本研究从刺葡萄愈伤组织中分离获得VdUFGT的cDNA 和DNA 全长序列分别为1 371 bp 和1 448 bp,DNA 序列含有1 个长度为77 bp 的内含子。 生物信息学分析表明,VdUFGT基因编码一个酸性、带负电荷的不稳定亲水蛋白,属于UDPGT 超家族成员；由UFGT同源基因编码蛋白所构建的进化关系,与植物真实进化的关系相一致,刺葡萄与美洲葡萄的亲缘关系较近,进化上可能属于较原始的类型。 红色刺葡萄愈伤组织的VdUFGT基因转录水平极显著高于白色刺葡萄愈伤组织的转录水平；在刺葡萄愈伤组织的连续培养过程中,VdUFGT对红色愈伤组织细胞培养物中的花青素合成有重要的调控作用,这种调控作用主要发生在刺葡萄愈伤组织培养的细胞快速生长的中期和细胞衰老的初期。 本研究结果为刺葡萄细胞培养生产花青素的合成调控研究提供了理论依据。