高氨基酸和高茶氨酸茶树资源筛选

方开星 姜晓辉 秦丹丹 李红建 黄华林 潘晨东 李 波 吴华玲

(广东省农业科学院茶叶研究所/广东省茶树资源创新利用重点实验室,广东 广州 510640)

氨基酸是茶树中一类重要的化学物质。 茶树中存在28 种氨基酸,且一般以茶树的特征性组分茶氨酸含量最多,约占游离氨基酸的30%～70%[1]。 氨基酸总量对茶叶的滋味、香气、汤色、叶底等具有影响[2-4],与茶叶品质呈显著正相关[5]。 此外,大量研究表明,茶氨酸具有镇静、安神、保护神经、降血压、降血脂、抗肿瘤、肝保护、增强免疫等功能[6-11]。 因此,高氨基酸和高茶氨酸茶树新品种选育是茶树遗传改良的重要方向。

一般认为茶树一芽二叶氨基酸总量大于5%为高氨基酸资源[12],茶氨酸含量大于3%为高茶氨酸资源[13]。 近年来,诸多研究者以高氨基酸和高茶氨酸含量为参考指标对国内茶叶资源进行了广泛筛选,获得了一大批高氨基酸茶树种质。 如赵洋等[14]对湖南湘西保靖县葫芦镇黄金村的一个高氨基酸茶树群体共76 份资源进行氨基酸含量测定,获得36 份高氨基酸茶树资源,1 份高茶氨酸茶树资源,并选育了黄金茶1号、黄金茶2 号和黄金茶168 号这3 个高氨基酸茶树新品种。 金孝芳等[15]对湖北的茶树资源进行筛选获得了E1 和20-2-1 这2 个高氨基酸茶树资源。 此外,一些黄化和白化变异品种具有高氨基酸特性,根据其受环境影响又可分为光照敏感突变型茶树(如黄金芽、白鸡冠和中黄1 号等)和温度敏感突变型茶树(如安吉白茶)[16-17]。 由于高氨基酸茶树资源在不同地理环境条件下含量存在差异且大部分具有高氨基酸,因此在华南地区筛选综合性状优良的高氨基酸茶树资源具有重要意义。

广东省农业科学院茶叶研究所茶树资源与育种团队一直致力于茶树种质资源收集、保存、鉴评与新品种选育研究,建有“广东省茶树种质资源库”,现保存国内外茶树种质资源共1 800 余份,涵盖大叶、中叶、小叶、乔木、小乔木、灌木等多种类型。 为充分利用这些资源,从中筛选出高氨基酸和高茶氨酸茶树种质,本研究对收集保存的218 份茶树核心材料的氨基酸含量和茶氨酸含量进行测定,以期为优良高氨基酸和高茶氨酸茶树新品种选育及其形成机理研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以保存于广东省农业科学院茶叶研究所广东省茶树资源库的218 份茶树资源[包括茶及其变种(阿萨姆变种、白毛茶变种和毛叶茶变种)]为研究对象。

1.2 氨基酸标准曲线绘制

准确称量0.2 g 谷氨酸粉末,溶解于70 mL 水中,并在100 mL 容量瓶中定容,配置成2 mg·mL-1的谷氨酸母液。 用移液管分别吸取0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、1、1.25、2.5、3.75 mL 的母液于5 mL 容量瓶中,定容配置成浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mg·mL-1的工作液。

谷氨酸溶液经0.22 μm 滤膜抽滤后,分别取0.5 mL pH 值8.0 的磷酸缓冲液及0.5 mL 2%茚三酮溶液于10 mL 的离心管中混匀,然后置于100℃水浴锅中加热15 min,期间每隔3 min 混匀一次。 加热结束后取出,在室温下冷却。 定容至10 mL 后,取250 μL 于96 孔酶标板上,并检测吸光度值。 通过吸光度值推算氨基酸含量。 每个样品设4 次重复。

1.3 茶氨酸标准曲线绘制

准确称量茶氨酸0.2 g 溶解于80 mL 水中,并用容量瓶定容到100 mL,配置成2 mg·mL-1的母液,分别取0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.500、0.750 mL,用水稀释定容至100 mL,制备成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mg·mL-1的工作液。

茶氨酸检测之前根据安捷伦公司氨基酸衍生试剂包中提供的方法进行邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生。 流动相A 为40 mmol·L-1Na2HPO4(pH 值8.0)；流动相B 为乙睛∶甲醇∶水(45 ∶45 ∶10,v ∶v ∶v)的混合物。 流速为2 mL·min-1,检测波长为338 nm。 梯度洗脱程序详见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Program of gradient elution

1.4 样品制备

春季采集218 份茶树种质资源新梢一芽二叶,采用蒸气杀青、烘箱干燥固样,并用YM203 磨碎机(奥克斯,中国)进行研磨,过0.1 mm 孔径筛,备用。 准确称量0.1 g 样品于10 mL 玻璃离心管中,用移液管加入10 mL 100℃的超纯水并密封。 混匀后置于100℃水浴锅中加热45 min,每隔10 min 混匀一次。 每个样品设3 次生物学重复。 冷却后用5417R 离心机(Eppendorf,德国)低速离心后抽滤。 参照1.2 和1.3 进行样品氨基酸和茶氨酸含量的测定。

2 结果与分析

2.1 218 份茶树资源一芽二叶氨基酸含量测定

将10 个不同梯度浓度的谷氨酸经显色反应后冷却,定容,取250 μL 于96 孔板中。 利用酶标仪测定吸光值,绘制标准曲线,标准曲线公式为y=0.601 8x+0.149 2,其中x为氨基酸浓度,y为吸光度值(图1)。通过推算,氨基酸干物质含量=(OD 值×10-1.492)/0.6018×100%。 将218 份种质资源的样品与茚三酮溶液反应后,加入到96 孔板中,每列2 个样品,每个样品4 个重复,不同样品在96 孔板中显色存在差异,表明不同资源的氨基酸含量不同,颜色越深氨基酸含量越高(图2,因种质样品较多,故仅随机选取的23 份种质样品显色示意图)。 利用酶标仪对96 孔板进行吸光度测定,结合标准曲线进行换算,获得不同茶树种质氨基酸含量(表2)。 结果表明,218 份资源一芽二叶氨基酸含量介于1.50%～8.98%之间,呈正态分布(图3),其中氨基酸含量介于3.00%～5.00%之间的样品有118 个,占样品数的54.1%,氨基酸含量介于2.00%～6.00%的样品有191 个,占样品数的87.6%。 氨基酸总量≥5.00%的高氨基酸茶树资源有55 个,占总量的25.2%,其中含量分布介于5%～6%的资源有37个,占总样品数的17.0%；含量分布介于6%～7%的资源有14 个,占总样品数的6.4%；含量＞7%的资源有4个,占总样品数的1.8%,含量介于7%～8%的资源有1个,含量介于8%～9%的资源3 个(表2)。

图1 氨基酸标准曲线Fig.1 Standard curve of amino acid

表2 218份茶树种质氨基酸和茶氨酸含量Tbale 2 Content of amino acid and theanine in 218 tea germplasms

表2 (续)

表2 (续)

表2 (续)

表2 (续)

图2 氨基酸显色反应Fig.2 Chromogenic reaction of amino acid

2.2 218 份茶树资源一芽二叶茶氨酸含量分析

利用高效液相色谱仪对不同浓度的茶氨酸工作液进行检测(图4),根据检测结果绘制标准曲线。 通过换算可得茶树茶氨酸含量=峰面积/52.36×100%。 同时,对218 份茶树资源一芽二叶茶氨酸含量进行测定,检测结果表明,218 份茶树样品的茶氨酸介于0%～4.03%之间(表2),呈正态分布(图5)。 茶氨酸含量主要分布于1%～2%之间,呈中等水平,该区间样品数共111 个,占总样品数的50.9%,茶氨酸≥3%的样品有13 个,占样品总数6.0%,分别为凌云11 号(3.83%)、凌云6 号(4.03%)、短节白毫(4.01%)、广宁大叶青心4 号(3.88%)、云南大叶(3.64%)、凌云10 号(3.44%)、云魂(3.38%)、凤庆1 号(3.37%)、肯尼亚12 号(3.37%)、凌云18 号(3.16%)、黄奇(3.12%)、惠阳小叶1号(3.04%)和凌云4号(3.02%)。 此外,MY355、D4、D29 和B22 这4 份毛叶茶资源无茶氨酸,占样品总数的1.8%(表2)。

图3 218 份茶树资源氨基酸含量正态分布图Fig.3 Normal distribution of amino acid contents of 218 tea germplasms

2.3 218 份茶树资源一芽二叶茶氨酸/氨基酸含量的比值

对218 份茶树资源一芽二叶茶氨酸与氨基酸含量的比值进行分析,结果表明,茶氨酸与氨基酸含量的比值在0～0.78 之间(表2),呈正态分布(图6)。 茶氨酸与氨基酸含量的比值主要分布于0.2 ～0.5 之间,该区间样品数155 个,占总样品数的71.1%。 茶氨酸与氨基酸含量的比值＞0.6 的样品有10 个,占样品总数的4.6%,分别为广宁大叶青心4 号(0.78)、惠阳小叶2号(0.78)、新选2 号(0.77)、凌云16 号(0.73)、凌云10 号(0.73)、红叶22 号(0.64)、优选10 号(0.62)、红叶4 号(0.61)、丹霞1 号(0.61) 和新选11 号(0.61)。 对218 个样品的氨基酸和茶氨酸含量进行相关性分析,发现茶叶中的茶氨酸与氨基酸含量相关性系数达0.752,R2为0.564,呈极显著正相关。

图4 高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸含量Fig.4 Theanine contents of tea germplasms determinated by HPLC

图5 218 份资源茶氨酸含量正态分布图Fig.5 Normal distribution of theanine contents of 218 tea germplasms

图6 218 份茶树资源茶氨酸与氨基酸含量比值的正态分布图Fig.6 Normal distribution of ratio value of theanine content to amino acid content of 218 tea germplasms

3 讨论

氨基酸含量是影响茶树品种成茶品质的重要参考因子,氨基酸尤其是茶氨酸与绿茶品质呈显著正相关[18-19]。 高氨基酸和高茶氨酸茶树资源在自然界分布较少,从中选育获得综合性状好的品种更少,安吉白茶是目前报道最多、应用范围最广的高氨基酸茶树品种,由于其鲜爽甘醇的优异品质,其推广应用极大带动了茶叶产业的发展,取得了较好的经济和社会效益[20]。 但由于氨基酸和茶氨酸含量是由多基因控制的数量性状,受光照、温度及土壤养分等环境影响较大,同一品种在不同地方其含量存在差异[21-22]。 广东地处热带与亚热带交融区,温度相对较高,低于19℃的时间短,不利于温度敏感型的安吉白茶形成高氨基酸特性[23],因此安吉白茶不适合在以广东为代表的华南地区种植。 为选育适合广东乃至华南茶区种植的高茶氨酸茶树品种,本研究通过对保存于广东省茶树种质资源库的218 份核心种质进行氨基酸及茶氨酸检测,共获得了55 份高氨基酸茶树资源和13 份高茶氨酸资源。

游离氨基酸是一种含氮化学物质[24-25],国标法利用茚三酮显色结合分光光度计法对样品氨基酸含量进行测定[26],测定样品用量较大(蒸青样3 g)。 当分析的茶树种质资源数量较多时,利用国标法进行氨基酸测定非常耗时,且某些稀有种质由于可用于分析的样品有限,而无法进行氨基酸检测。 而本研究创新开发的基于茚三酮显色结合酶标仪的微量法可以快速对样品进行检测[27]。 检测结果显示茶氨酸与氨基酸含量的比值介于0～0.78 之间,且主要分布于0.2 ～0.5 之间,这与前人研究发现茶叶中茶氨酸含量约占游离总氨基酸的30%～70%存在差别[28],其原因可能是本研究采用茚三酮显色法测定总游离氨基酸含量值偏大的缘故。 相关性研究表明,茶氨酸与氨基酸含量的相关系数为0.752,呈极显著正相关,因此在大规模的资源筛选时,可先根据各资源已知的氨基酸总量推测其茶氨酸大概的含量,缩小资源筛选范围,再采用液相色谱进行茶氨酸精确测定,快速定向选育出高茶氨酸种质。

茶叶中游离氨基酸多达28 种[29],其共同决定了茶叶中总氨基酸含量。 不同的茶树种质体内的氨基酸的种类及含量存在较大差异。 如尹杰等[30]对贵州名茶的氨基酸组成及含量进行研究发现,贵州各种名茶除茶氨酸外还存在其他含量突出的氨基酸,如都匀毛尖的酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸含量较高；遵义毛峰的苯丙氨酸、胱氨酸含量高；湄江翠片的谷氨酸；山京翠芽的赖氨酸和羊艾毛峰的天冬氨酸含量较高。 上述结果表明,不同品种氨基酸种类和含量的差异影响了氨基酸的总量,同时也造成了茶叶香气和滋味的不同。 对于本研究筛选出高茶氨酸茶树种质,今后将有必要进一步跟踪测定各氨基酸组分含量。

作为茶叶中最重要的氨基酸,茶氨酸是茶叶次生代谢物的重点研究对象[31]。 茶氨酸的代谢通路基本已经探明[32-35],但是有关茶树形成高茶氨酸的调控机制的研究尚鲜见报道。 目前已报道的主要是以低温敏感型和光照敏感型资源为材料通过多组学技术手段,对其高茶氨酸形成的机制进行解析[36-37]。 正常的茶树品种受温度和光照的影响较低温敏感型和光照敏感型资源小,可能从其他途径调控高茶氨酸的形成[38]。本研究筛选了多份高茶氨酸及低茶氨酸茶树资源,为茶树高茶氨酸形成的调控机理研究提供了丰富的材料。 随着茶树基因的公布[39-40],可充分利用茶氨酸特异资源开展数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位、关联分析及多组学技术获得与其相关的分子标记、基因、蛋白及特征代谢物,解析其高含量形成的机理。

4 结论

本研究对218 份茶树资源春季一芽二叶氨基酸及茶氨酸含量进行测定,筛选获得了55 份高氨基酸茶树资源,13 份高茶氨酸茶树资源和4 份无茶氨酸茶树资源。 本研究为高氨基酸总量及高茶氨酸含量茶树新品种选育、茶氨酸合成机理研究提供了材料基础。