早期胃癌患者H.pylori感染与活检组织PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白的关系

杜登泰， 杨 刚， 陈 仕

湖南省脑科医院消化科 湖南中医药大学临床医学院，湖南 长沙 410000

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，具有较高的发病率及死亡率，严重威胁人类生命安全。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌发展的重要危险因素，其能诱导产生多种炎性介质及胃黏膜上皮细胞的增殖及凋亡异常，并可调控癌基因及抑癌基因的表达，在胃癌发病进展过程中占据重要角色[1]。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)是一种抑癌基因，可调控细胞增殖、死亡、迁移及黏附等；性别决定相关基因簇2(SOX2)在组织分化及发育过程中具有重要作用，是调控胃黏膜上皮细胞分化的一种重要转录因子；核因子κB p65(NF-κB p65)属于转录调节因子，可调节细胞增殖基因及抗凋亡基因的表达。相关研究[2-4]显示，PTEN、SOX2及NF-κB p65均在胃癌的发生、发展中发挥重要作用。另有研究[5]显示，H.pylori感染可导致胃炎患者胃黏膜NF-κB p65表达水平升高，对胃癌的发生具有协同作用。本研究特采用免疫组化法检测胃癌组织及癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白阳性表达情况，并探讨其与H.pylori感染的相关性，以期为H.pylori相关性胃癌发生机制及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年1月至2018年2月湖南省脑科医院收治的确诊为早期胃癌并接受手术的患者128例，其中H.pylori感染阴性者43例(H.pylori阴性组)，H.pylori感染阳性者85例(H.pylori阳性组)。H.pylori阴性组:男27例，女16例，年龄(68.46±10.19)岁(42～83岁)，肿瘤最大直径(3.59±0.71)cm(0.41～6.28 cm)，发病部位：胃窦部25例，胃底贲门部11例，胃体部7例；组织分型：腺癌21例，鳞腺癌8例，鳞癌12例，类癌2例。H.pylori阳性组:男52例，女33例，年龄(67.24±10.65)岁(45～81岁)，肿瘤最大直径(3.51±0.68)cm(0.45～6.19 cm)，发病部位：胃窦部49例，胃底贲门部22例，胃体部14例；组织分型：腺癌41例，鳞腺癌15例，鳞癌23例，类癌6例。两组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，且本研究获得医院伦理委员会批准。

纳入标准：均符合早期胃癌诊断标准[6]，均进行手术治疗，且均经病理学检查确诊；且阳性组符合H.pylori感染诊断标准[6]；均未接受放化疗、生物治疗，患者或家属均签署知情同意书。

排除标准：急性胃炎、胃溃疡等其他胃部疾病者，伴有其他部位肿瘤者，接受过抗生素、胶态铋、糖皮质激素、质子泵抑制剂等治疗者，伴有其他严重内科疾病者，伴自身免疫性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 试剂：PTEN、SOX2及NF-κB p65抗体均购自上海优宁维生物科技公司，生物素标记二抗山羊抗兔购自杭州百细生物科技公司，免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司，磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自杭州科易生物技术公司；Giemsa染色剂购自上海联硕生物科技有限公司。

1.2.2 癌旁组织标本获取：胃癌手术过程中，取距肿瘤边界>5 cm处组织，并经病理检查证实为正常胃黏膜上皮组织。

1.2.3H.pylori检测方法：(1)采用13C尿素呼气试验法，检查前患者禁食6 h以上，检查时让患者先吹气1次，然后口服1粒13C尿素胶囊，静坐20 min、30 min后再分别吹气1次(嘱患者用力适度)，呼气完毕后立即拧紧采集试管的盖子并送检，测定结果超基准值DOB>4.4为阳性；(2)采用改良Giemsa染色：取存档的胃癌组织及癌旁组织石蜡标本，切片，常规脱蜡复水，放入质量浓度为20 g/L的Giemsa染色剂进行染色30 min，清水冲洗后，迅速置入100%乙醇内进行脱水，然后二甲苯透明并树胶封固，在油镜下观察H.pylori，阳性：组织呈紫红色，H.pylori呈淡蓝色至蓝色，且细菌形态明显(弯曲状或弧形)。上述两种方法检测均为阳性结果，则诊断为H.pylori阳性。

1.2.4 免疫组织化学法检测组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况：取存档的胃癌组织及癌旁组织石蜡标本，切成厚度约4 μm薄片，石蜡切片烤片80 min(60 ℃)，二甲苯脱蜡40 min，梯度酒精脱水35 min，3% H2O2去离子水孵育10 min(37 ℃)，PBS冲洗3次，置入枸橼酸盐缓冲液高温(95 ℃)修复10 min，待冷却至室温后，用PBS冲洗3次，分别滴加20 μl的兔抗人PTEN、SOX2和NF-κB p65抗体(1∶100倍稀释)，将切片放于湿盒内，4 ℃冰箱孵育过夜(另以PBS代替一抗作为阴性对照)，室温下PBS冲洗3次，滴加50 μl兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入50 μl链霉素卵白素(辣根过氧化物酶标记过)，加入100 μl的DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化、脱水、透明、干燥、封片；倒置显微镜下随机观察10个高倍镜视野，计100个细胞数。

1.3 观察指标(1)H.pylori感染阴性及阳性胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况；(2)H.pylori感染阴性及阳性癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况；(3)胃癌及癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况：PTEN阳性：细胞质内呈现棕黄色颗粒；SOX2阳性：细胞核呈现棕黄色颗粒；NF-κB p65阳性：细胞浆呈现棕黄色颗粒，伴极少许细胞核；阳性细胞百分比>10%计为阳性表达；阳性细胞着色程度：无阳性染色细胞计为0分，浅黄色计为1分，黄色计为2分，棕黄色计为3分；阳性细胞占比：未见阳性细胞计为0分，阳性细胞占比≤10%计为1分，阳性细胞占比>10%且≤5%计为2分，阳性细胞占比>50%且≤75%计为3分，阳性细胞占比>75%计为4分；将阳性细胞着色程度与阳性细胞占比的乘积结果划分为4个等级，其中0分为-(阴性)，1～2分为+(弱阳性)，3～5分为++(中等阳性)，6～12分为+++(强阳性)[7]。(4)H.pylori感染阳性与胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白表达相关性。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，两样本计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Logistic回归分析法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1H.pylori阴性及阳性胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况H.pylori阳性组胃癌组织PTEN及SOX2阳性率均明显低于H.pylori阴性组(P<0.05)，H.pylori阳性组胃癌组织NF-κB p65阳性率明显高于H.pylori阴性组(P<0.05，见表1)。

2.2H.pylori阴性及阳性癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况H.pylori阳性组癌旁组织PTEN及SOX2阳性率均明显低于H.pylori阴性组(P<0.05)，H.pylori阳性组癌旁组织NF-κB p65阳性率明显高于H.pylori阴性组(P<0.05，见表2)。

表1H.pylori阴性及阳性胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性率
Tab 1 Positive expressions rates of PTEN, SOX2 and NF-κB p65inH.pylorinegative and positive gastric cancer tissues

比例/%

表2H.pylori阴性及阳性癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性率
Tab 2 Positive expressions rates of PTEN, SOX2 and NF-κBp65 inH.pylorinegative and positive paracancerous tissues比例/%

组别例数PTENSOX2NF-κB p65H.pylori阳性癌旁组织8569(81.18)76(89.41)36(42.35)H.pylori阴性癌旁组织4342(97.67)43(100)7(16.28)χ2值6.7484.8978.702P值0.0090.0270.000

2.3 胃癌及癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性表达情况胃癌组织PTEN及SOX2阳性率均明显低于癌旁组织(P<0.05)，胃癌组织NF-κB p65阳性率明显高于癌旁组织(P<0.05，见表3)。

表3 胃癌及癌旁组织PTEN、SOX2和NF-κB p65阳性率
Tab 3 Positive expressions rates of PTEN, SOX2 and NF-κB p65 in gastric cancer and paracancerous tissues比例/%

组别例数PTENSOX2NF-κB p65胃癌组织12858(45.31)71(55.47)112(87.50)癌旁组织128111(86.72)119(92.97)43(33.59)χ2值48.90947.03577.855P值0.0000.0000.000

2.4H.pylori阳性与胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白表达相关性经Logistic回归分析，胃癌组织PTEN、SOX2蛋白阳性表达降低H.pylori感染风险(OR=0.483、0.562，P<0.05)，NF-κB p65蛋白阳性表达增加H.pylori感染风险(OR=3.871，P<0.05，见表4)。

表4 H.pylori阳性与胃癌组织PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白表达相关性分析Tab 4 Relevance analysis of H.pylori infection with PTEN, SOX2 and NF-κB p65 protein expressions

2.5 免疫组化检测结果经免疫组化检测，PTEN、SOX2及NF-κB p65在癌旁组织及胃癌组织中的表达见图1。PTEN在癌旁组织中等阳性表达(++)，在胃癌组织弱阳性表达(+)；SOX2在癌旁组织强阳性表达(+++)，在胃癌组织弱阳性表达(+)；NF-κB p65在癌旁组织阴性表达(-)，在胃癌组织中等阳性表达(++)。

图1 免疫组化检测结果(200×) A：PTEN在癌旁组织等阳性表达(++)；B：PTEN在胃癌组织弱阳性表达(+)；C：SOX2在癌

Fig 1 Immunohistochemical results (200×)A: medium positive expression of PTEN in paracancerous tissue (++); B: weak positive expression of PTEN in gastric cancer tissue (+); C: strong positive expression of SOX2 in paracancerous tissue (+++); D: weak positive expression of SOX2 in gastric cancer tissue (+); E: negative expression of NF-κB p65 in paracancerous tissue (-); F: medium positive expression of NF-κB p65 in gastric cancer tissue (++)

3 讨论

胃癌是慢性胃炎-肠上皮化生-不典型增生-胃癌逐步发展演变的过程，其发生、发展是多种因素共同作用的结果，包括H.pylori感染、地域环境、饮食、遗传等，其中H.pylori感染是首要致病因素[8]。H.pylori感染致病机制复杂，可能与其引起胃黏膜炎症、周期调控蛋白异常表达及细菌毒力因子直接损伤胃黏膜等有关[9]。另有相关研究[10-12]表明，PTEN、SOX2和NF-κB p65蛋白均参与胃癌的发生、发展。本研究特对H.pylori感染早期胃癌患者进行组织蛋白PTEN、SOX2和NF-κB p65检测，并探讨其相关性。

本研究结果发现，H.pylori阳性胃癌组织、癌旁组织中PTEN及SOX2阳性率明显低于阴性组，H.pylori阳性胃癌组织、癌旁组织中NF-κB p65阳性率明显高于H.pylori阴性组，提示H.pylori感染早期胃癌患者胃癌组织及癌旁组织中PTEN及SOX2蛋白阳性率均明显低于非H.pylori感染者，而NF-κB p65蛋白阳性率明显高于非H.pylori感染者。有研究[13]显示，H.pylori感染可诱导PTEN基因磷酸化失活。另有研究[14]显示，H.pylori阳性患者胃癌组织SOX2蛋白阳性率低于H.pylori阴性患者，此与本研究结果相一致。H.pylori感染引发胃炎，促使大量炎症细胞因子如肿瘤坏死因子、白介素及干扰素等产生，促使胃黏膜上皮细胞异常甲基化，抑制PTEN表达，促使SOX2表达降低。另有研究[15]表明，H.pylori感染后NF-κB呈激活状态。修丽娟等[16]研究显示，H.pylori阳性的胃癌组织中NF-κB p65蛋白阳性率高于H.pylori阴性胃癌组织，此与本研究结果相符合。H.pylori感染可刺激炎症介质产生，促使胃黏膜固有层免疫炎症细胞聚集及活化，炎症相关因子过表达可反方向激活NF-κB p65。因此，与非H.pylori感染早期胃癌患者相比，H.pylori感染早期胃癌患者癌组织PTEN及SOX2蛋白阳性率明显降低，而NF-κB p65阳性率明显升高。

本研究结果还发现，胃癌组织PTEN、SOX2阳性率明显低于癌旁组织，胃癌组织NF-κB p65阳性率明显高于癌旁组织，提示早期胃癌患者癌组织中PTEN、SOX2蛋白阳性率降低，而NF-κB p65阳性率升高。有研究[17]显示，PTEN基因在正常胃组织中高表达，而在癌组织中低表达。PTEN蛋白可使某些蛋白激酶及磷脂的某个位点去磷酸化，从而能够抑制细胞周期进展及介导细胞凋亡，且能调控细胞黏附、迁移、分化及扩散等，具有抗癌作用；PTEN缺失则对细胞分化的抑制作用降低，可使异型细胞逐步转变为肿瘤细胞，且可降低细胞黏附及促进肿瘤细胞新生血管生成，进而促进肿瘤细胞侵袭及转移，促进胃癌发展[18]。有研究[19]表明，正常胃黏膜SOX2呈阳性表达，而在慢性胃炎、肠化生及胃癌中表达下降。转录因子SOX2在维持与调节肿瘤干细胞侵袭力及自我更新方面起着重要作用，其可促使细胞周期蛋白表达下调及抑制细胞周期转化，进而促使细胞周期停滞及凋亡，起到肿瘤抑制作用；SOX2蛋白表达明显下降，则调控胃上皮细胞的分化作用减弱，胃分化标志物表达减少，胃癌细胞浸润、增殖及转移能力增强，促进胃癌发生[20]。另有研究[21]表明，NF-κB p65在胃癌患者癌组织中异常激活。NF-κB是免疫及炎症反应关键调节因子，在癌细胞转化、增殖、新生血管生成及转移过程中发挥重要作用，其中NF-κB p65是NF-κB最常见活化形式，其激活后可通过对基因转录的调控作用而促进肿瘤细胞增殖及转移；NF-κB p65表达水平升高，诱导免疫和炎症调节基因、细胞增殖基因及抗凋亡基因等靶基因的表达，促使癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡，在胃癌的发生、发展中起重要作用[22]。此外，有研究[23-25]显示，胃癌组织中PTEN、SOX2及NF-κB p65的阳性表达与肿瘤分化程度、浸润程度及淋巴结转移等有关，当肿瘤分化程度越低、浸润程度越深及出现淋巴结转移时，PTEN、SOX2阳性表达随之减少，而NF-κB p65阳性表达随之增多。因此，在早期胃癌组织中，PTEN、SOX2蛋白阳性表达率明显降低，NF-κB p65蛋白阳性率明显升高，但其表达是否与胃癌组织类型及部位有关，尚需进一步探讨。

此外，本研究结果发现，胃癌组织PTEN、SOX2蛋白阳性表达降低H.pylori感染风险(OR=0.483、0.562，P<0.05)，NF-κB p65蛋白阳性表达增加H.pylori感染风险(OR=3.871，P<0.05)，提示H.pylori感染与早期胃癌患者癌组织PTEN、SOX2及NF-κB p65蛋白的表达有相关性。结合上述研究分析，H.pylori感染可促使胃癌组织中PTEN、SOX2蛋白异常失活，但可刺激NF-κB p65蛋白活化，H.pylori感染及PTEN、SOX2、NF-κB p65蛋白在胃癌的发生、发展过程中关系密切。

综上，H.pylori感染早期胃癌患者胃癌组织中PTEN、SOX2蛋白表达明显降低，而NF-κB p65蛋白表达明显升高，H.pylori可能是通过影响PTEN、SOX2及NF-κB p65蛋白的表达而参与胃癌的致病过程。