替诺福韦酯初始治疗应答不佳的相关因素分析：病例报道及文献复习

曹敏玲， 池晓玲， 蒋俊民， 唐永煌， 周粤湘

1.广东省中医院肝病科，广东 广州 510120； 2.华侨医院； 3.广州中医药大学

解放军传染病研究所对1 740例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者对替诺福韦酯(TDF)耐药可能相关突变位点进行分析[1]，目的是通过大样本测序分析CHB患者HBV反转录酶(reverse transcriptase, RT)序列，明确TDF耐药可能相关的突变在我国患者未使用该药前的检出状况，预测TDF在我国临床的应用前景。通过收集1 740例CHB患者血清，提取血清中的HBV DNA，采用巢式PCR方法扩增HBV RT基因，对PCR产物进行DNA测序，NTI软件比对结果。检测与核苷(酸)类似物耐药的相关RT区12个位点测序，重点分析与TDF临床耐药可能相关的A194T突变及体外证实可降低TDF活性的V214A、Q215S和A181V+N236T突变。结果显示，540例(31%)患者分别检测出了拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)耐药相关突变；未检出A194T突变；34例(2.0%)患者检出V214A突变；3例(0.2%)患者检出Q215S突变，15例(0.9%)患者检出A181V+N236T(其中3例为A181V/T+N236T)突变。最终未检出与TDF临床耐药可能相关的A194T突变，提示我国目前CHB患者自然发生或应用核苷(酸)类似物后引起的TDF原发耐药的可能性很小，预测该药在我国治疗对4种抗HBV核苷(酸)类似物耐药的患者应具有较好疗效。但截至2018年8月，国内暂未出现TDF耐药案例。

本文介绍了1例40岁的HBeAg阴性CHB男性患者接受TDF 300 mg/d治疗，初始HBV定量基线水平较低，在治疗后6个月无法检测。然而，在TDF治疗12个月后出现反弹。我们试图找到与病毒学突破相关的突变位点，最终双中心耐药基因分析结果显示未找到突变位点。本文在最后也对患者TDF应答不佳的情况进行确认，并对造成TDF应答不佳的几种因素进行分析，以供业界参考。

1 病例

患者,男，40岁,广东工业大学教师，1998年体检发现澳抗阳性，2016年5月体检发现AFP升高，入住中山大学附属肿瘤医院查AFP：1 654 ng/ml；腹部CT：肝S1/8不规则肿块(29 mm×25 mm)，考虑肝癌，侵犯门脉主干、门脉左支及其分支并肿物形成，侵犯下腔静脉肝段、肝中静脉；2016年6月13日查AFP：1 654 ng/ml，HBV DNA定量：2 170 IU/ml；影像学确诊肝恶性肿瘤，于中山大学肿瘤医院行TACE术控制肿瘤，术程顺利，6月27日出院。2016年7月18日复查影像学提示肿瘤无缩小，复查AFP：4 450 ng/ml，HBV DNA定量：570 IU/ml；开始口服TDF(韦瑞德)抗病毒，甲磺酸阿帕替尼片(艾坦，0.5 g 口服 1次/d)控制肿瘤。2016年7月27日至2016年10月12日AFP从4 801 ng/ml下降至434.7 ng/ml。2017年1月17日复查AFP 2 983 ng/ml；上腹部MR增强提示肿瘤进展，停艾坦，改服索拉菲尼(印度Nactco，400 mg口服，1次/d)，TDF继续用药，2017年2月15日至5月2日AFP从7 801 ng/ml上升至13 145 ng/ml，4月10日MR提示肿瘤进展，停用索拉菲尼。2017年5月13日行肝动脉灌注化疗(TAI),过程顺利，5月13日下午出院，5月14日重新口服索拉菲尼。2017年6月5日、6月22日、7月28日先后行TAI，手术期间停服索拉菲尼2 d，术后正常服用，TDF未停服。2017年8月17日MR增强提示肿瘤进展，停用索拉菲尼。2017年9月1日改用瑞戈菲尼(德国拜耳，160 mg口服 1次/d)，因副作用大，10 d后停药。10月28日AFP下降至27 662 ng/ml。2017年11月2日、11月16日于广州市肿瘤医院注射纳武单抗(opodivo，180 mg，香港购)；2017年11月2日HBV DNA定量1.13E3 IU/ml。2017年11月16日复查AFP上升至30 629 ng/ml；HBV DNA定量1.13E3 IU/ml；2017年11月30日因胆红素升高行胆管支架手术，12月1日HBV DNA定量1.76E3 IU/ml；2017年12月13日出院，出院后护肝治疗，胆红素由86.4 mmol/L下降至37.2 mmol/L。2018年1月9日复查AFP 121 000 ng/ml，开始口服乐伐替尼(Lenvima，10 mg 口服，每晚1次，香港购)至死亡前1个月。2018年1月10日开始入住广东省中医院肝病科。2018年1月28日HBV DNA定量检测：3.02E2 IU/ml；入院后反复复查HBV定量均阳性，2 000～30 000 IU/ml，双检验中心对患者血样进行多次耐药基因分析，均未能检测出耐药位点。后因肝癌病情进展迅速于2018年3月1日去世。

2 讨论

2.1 TDF应答不佳的确认既往国内外不同的CHB指南对核苷(酸)类似物抗病毒治疗的应答不佳采用了不同的定义。综合考虑核苷(酸)类似物治疗早期病毒学下降既往国内外不同的CHB指南对核苷(酸)类似物抗病毒治疗的应答不佳采用了不同的定义。综合考虑核苷(酸)类似物治疗早期病毒学下降。HBV耐药评估：对于核苷(酸)类似物治疗24周HBV DNA仍未转阴，尤其是治疗期间出现病毒学反跳患者，可考虑进行HBV耐药检测。对于明确的HBV耐药患者，应根据患者所用核苷(酸)类似物种类及治疗期间HBV DNA动态变化等情况相应调整抗病毒治疗方案。对于ETV/TDF应答不佳患者，如基线HBV DNA≥1.0×108IU/ml，推荐加用无交叉耐药的核苷(酸)类似物联合抗病毒治疗；如患者基线HBV DNA<1.0×108IU/ml，推荐原方案治疗至48周再评估(B1)。 根据专家共识，本例患者用药24周后检测病毒定量阴性，48周后病毒定量重新检测，患者为TDF初治，双中心(广东省中医院检验中心/金域检验中心)检测对HBV定量及耐药基因分析进行了多次重复检测，均提示病毒学反跳，但均未发现耐药位点，虽患者依从性极好，但临床仍考虑TDF应答不佳。

2.2 TDF常见耐药位点及本次检测位点对比2018年韩国一个疑似TDF耐药案例报道中提到[2]，在经过43周连续治疗的单纯CHB使用TDF初治患者血样中进行全基因测序，可以被检测到的可疑耐药位点有11个，可疑位点为rtY9H、rtL91I、rtS106C、rtS106G、rtT118C、rtT118G、rtQ267L、rtI269L、rtA317S、rtK333Q、rtN337H，但该病例只有1例，所检出耐药位点无对比性。既往全世界关于TDF耐药的病例研究里面[3-6]，HIV合并HBV使用TDF耐药位点是rtA194T、rtL180M、rtM204V[23-25]。金域检验中心检测HBV核苷类似物耐药包括常见的相关21个位点，包括rt80、rt84、rt85、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt207、rt213、rt214、rt215、rt229、rt233、rt236、rt237、rt238、rt250；同时检测HBV相关的9个基因型，具体为HBV A-H型及HBV C/D重组型。局限性：当病毒突变株<10%时，本方法难以检出，报告为阴性。EASL 2017指南提出TDF主要耐药位点为rt181及rt236(见表1)。本例患者在金域中心送检样本检测位点包含rtA194T、rtL180M、rtM204V、rt181及rt236等几个常见耐药位点，但均未发现突变位点。由图1可见，我院检验中心对8个常见位点进行检测，可检测出HBV，但未见突变位点，考虑为野生株。TDF作为一个无环核苷酸，具有更强大的抗病毒活性，在3年时间内未见耐药病例。在服药时间上，患者作为高校教师，治疗非常积极，依从性极强，规律服药1年出现病毒学突破，根据既往TDF数据，1年内耐药可能性极低。故经多学科讨论,本例患者更偏向于野生株病毒对TAF应答不佳。

表1 常用核苷类似物耐药位点分布(EASL 2017)Tab 1 Distribution of nucleoside analogue resistance site (EASL 2017)

2.3 TDF应答不佳可疑原因分析

2.3.1 TDF应答不佳可能与肿瘤进展相关：肿瘤免疫反应以细胞免疫为主，体液免疫为辅。参加细胞免疫的效应细胞主要有细胞毒性T细胞CTL、NK及巨噬细胞。CTL被白细胞介素2(IL-2)激活后可以通过其T细胞上的人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility compolex, MHC)Ⅰ型分子而释放。CTL的保护作用在对抗病毒所致的肿瘤(如EBV引起的伯基特淋巴瘤和HPV导致的肿瘤)时特别明显，不需要预先致敏的、能杀伤肿瘤细胞的淋巴细胞[7-8]。由IL-2激活后，NK细胞可以溶解多种人体肿瘤细胞不引起T细胞的免疫反应，因此，NK细胞是抗肿瘤免疫的第一线抵抗力量。NK细胞识别靶细胞的机制是细胞受体和抗体介导的细胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)。巨噬细胞与T细胞起到协同作用：T细胞产生的α-干扰素可激活巨噬细胞,而巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子代谢产物在溶解瘤细胞中起主要作用。体液免疫参加抗肿瘤反应的机制主要是激活补体和介导NK细胞参加抗肿瘤免疫的细胞效应。在肿瘤不断进展的过程中，细胞免疫的效应细胞和体液免疫的补体均会被“分流”，特别是对抗病毒的CTL因消耗过度无法参与HBV的灭活，同时，由于肿瘤进展引起免疫系统的崩塌，让HBV逃逸免疫反应,产生病毒学突破,创造更适合的体内环境。从图2～3得知，HBV DNA的波动与AFP具有明显的相关性，却与ALT波动无明显相关性。这表明，在肿瘤进展中，HBV DNA同时也发生了病毒学突破。

图1 患者耐药位点检测结果Fig 1 Test results of drug resistance sites for the patient

2.3.2 TDF应答不佳可能与胆汁淤积相关：TDF是口服药物。胆汁淤积会引起消化不良和腹胀、腹泻。不仅导致营养物质吸收障碍，而且导致部分药物的吸收障碍[9]。胆汁排泄不畅将导致胆囊壁肥厚和发炎。造成胆汁排泄不畅，一方面影响某些经胆汁排泄药物的消除过程，另一方面也影响多数具有肠肝循环药物的再吸收作用，必将影响相关药物的疗效。从图4也可看出，在胆红素发生第一次骤升时，患者也同时发生了病毒学突破。

2.3.3 TDF应答不佳可能与不同类别靶向抗肿瘤药物相关：与其他单克隆抗体相似，能特异性地阻断细胞内支配凋亡、增殖、分化的主要下游信号途径。抑制细胞周期；间接抑制肿瘤新生血管内皮细胞增殖; 促进细胞凋亡。另外，可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒效应及补体依赖的细胞毒效应，起到杀伤肿瘤细胞的作用。靶向治疗作用的位点是细胞癌变过程中的基因、受体和信号传导途径中的关键酶，这些关键酶又可能TDF抗病毒药效所共有，使药物无法发挥抗病毒疗效。从图5可见，患者在使用瑞戈菲尼及纳武单抗期间仍可检出HBV，在乐伐替尼治疗期间出现了HBV定量进行性升高，但在原始肝癌靶向药物索拉菲尼敏感期，HBV控制在不可检测范围。不同类别的靶向抗肿瘤药物可能与抗病毒药物之间存在着干扰作用。

图2 HBV DNA定量与AFP波动情况；图3 HBV DNA定量与ALT波动情况；图4 HBV DNA定量与TBIL波动情况；图5 HBV DNA定量与用药情况Fig 2 Changes in HBV quantification and AFP; Fig 3 Changes in HBV quantification and ALT; Fig 4 Changes in HBV quantification and TBIL; Fig 5 Changes in HBV quantification and medication

2.4 亮点

2.4.1 病例特征：本例患者最终因肝癌去世，在生命的最后3个月里，他坚定陈述口服TDF的规律性及剂量标准性，并多次希望我们能分享他的病历，作为高校教师，他也查询过国内外文献，认为本例病例的特殊性及罕见性，多次配合留取血样，希望能为科学进步尽最后一点贡献。另外他也提出捐赠器官的要求，最后请红十字会鉴定后，因疾病本身无法完成捐献器官意愿，作为主管医师没能帮他达成最后愿望表示无比遗憾。

2.4.2 临床诊断：患者为CHB初治，在口服TDF 1年后发生HBV DNA病毒学突破，两个不同医院(广东省中医院、中山肿瘤医院)的检验中心进行荧光PCR定量均证实病毒可测出(中山肿瘤医院：荧光定量PCR法，cobas Z480荧光定量PCR仪；广东省中医院HBV DNA检测方法：荧光探针法，ABI7500荧光定量PCR仪),为诊断应答不佳提供充分依据。

2.4.3 实验室诊断：广东省中医院检验中心与金域检验中心同期进行耐药基因分析结果均未发现突变位点，所检测的突变位点全部包含国际上已发布的关于TDF常见耐药位点。最终多学科讨论考虑乙肝病毒学突破原因为TDF应答不佳。

2.4.4 经验和教训：尽管最后我们尝试停用TDF，更换恩替卡韦，但患者肿瘤病情进展迅速，乃至不治。基于病例的特殊性及罕见性，我们邀请了药学部、肿瘤科、检验科及外院专家唐永煌教授来院进行病例大讨论，得出本例TDF应答不佳的几个可能原因，希望提供更多TDF的临床经验。