血清新型蛋白复合物与炎症性肠病活动度评估的关系

孙颖昊， 李 骥， 舒慧君， 李智立， 钱家鸣

1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京100730；2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医院基础医学院 生物物理及结构生物学系

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)，临床表现为反复发作的腹痛、腹泻、黏液血便等，严重影响患者的生活质量[1]。近年来，我国IBD患病率逐渐升高[2-3]，无论国内外指南均指出治疗方案的选择需建立在对病情进行全面评估的基础上，主要根据病情的严重程度和病变累及的范围制定治疗方案[4-5]。当前用于UC和CD疾病活动评估的指标分别包括临床活动度评分(改良Mayo评分和简化CDAI评分)、内镜下评分(Mayo内镜评分和SES-CD)、血清学指标(CRP、CRP/ALB)及粪钙卫蛋白等，但上述指标均有优劣之处。临床上仍需发掘更有价值的新的生物学标志物，蛋白质组学的研究则是一把解决此问题的利刃。新型循环免疫炎症相关蛋白复合物(immunoinflammation-related protein complexes, IIRPCs)是人血清中的一种蛋白复合物，其主要成分是一些与免疫系统、炎症系统和补体系统相关的蛋白质，既往研究表明，其在健康人群中含量较低，在肿瘤性疾病中含量升高[6]。本研究旨在探讨血清IIRPCs水平在IBD疾病活动度评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象纳入2012年11月至2016年5月于北京协和医院门诊或住院部就诊的69例UC患者和67例CD患者。IBD诊断符合2012年炎症性肠病诊断及治疗共识意见[4]。健康对照者需无明确消化系统肠道疾病、无消化系统及其他系统恶性肿瘤病史、无自身免疫病史。该研究获北京协和医院伦理委员会批准(S-K462)。

1.2 资料收集通过北京协和医院病案室和住院电子病历系统，查阅门诊及住院病案资料，收集患者临床资料。IBD患者记录基本信息(性别、年龄、发病年龄、病程、既往史、个人史、家族史)，完整诊断(Montreal分型)，临床活动度评估(CD患者采用HBI指数进行活动度评估[7]，UC患者采用改良Mayo评分[8])，实验室检查和结肠镜检查结果。对于CD患者，缓解期定义为HBI指数≤4分，>4分为活动期，其中5～8分为中度活动期，≥9分为重度活动期。对于UC患者，缓解期定义为改良Mayo评分≤2分且无单个分项评分>1分，否则为活动期，其中3～5分为轻度活动，6～10分为中度活动，11～12分为重度活动。

1.3 标本收集与储存收集患者临床检验后剩余标本(实验室指标结果与IIRPCs测量血清为同一日采集)，4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，吸取上层血清样本分装至1.5 ml Eppendorf 管(EP管)中，将分装标记好的血清储存于-80 ℃低温冰箱中备用,使用过程中避免反复冻融。

1.4 血清蛋白电泳为验证每次电泳结果的可靠性和一致性，随机选取6个样本，每个样本取200 μl放在一起混匀，制备混合血清作为质量控制样本(qualitycontrol，QC)。将混合血清分装至600 μl Eppendorf管(EP 管)中，每管100 μl。实验过程中保障每管QC样本冻融次数<5次。

按照实验室先前建立的Native-PAGE电泳的方法。采用4%～10%的梯度分离胶，由梯度混匀器制备。分离胶凝固后覆盖4%浓缩胶，每块胶有12个上样孔。电泳前将2 μl血清样本和8 μl 1×上样缓冲液(用超纯水稀释10×上样缓冲液至1×)混合后，加入至上样孔。每块凝胶中可加10个样本，其中包含一个QC样本。玻璃板参数：宽12 cm，长14 cm，厚度为1.5 mm。电泳参数：恒流，每块胶10 mA，持续1.5 h后，调整电流为每块胶25 mA，3 h后终止电泳。后3 h需要加入冷循环水控温。电泳结束后，利用考马斯亮蓝G-250进行染色过夜，然后用二级水进行脱色。

1.5 血清IIRPCs定量分析既往研究表明，人血清转铁蛋白相关蛋白复合物(transferrin-related protein complexes,TRPC)的含量相对稳定，在数千人群样本中的验证实验表明，血清TRPC含量与性别、年龄、IIRPCs类型、疾病或健康状态无关，因而可作为稳定的内参[6]。QC样本则作为外参，确保每次电泳结果的一致性。使用TRPC含量对血清样本的IIRPCs含量进行相对定量。利用Umax Powerlook 2100XL Scanner凝胶扫描仪扫描凝胶，图片存储为.tiff格式。根据凝胶条带，将样本分为不同的IIRPCs类型(见图1)。将凝胶图导入Quantity One软件(版本4.6.3，美国BioRad公司)，分析每例样本中IIRPCs的相对含量。在每块凝胶中，利用QC样本的TRPC含量对血清样本的TRPC含量进行相对定量。血清样本的TRPC含量为QC样本TRPC含量的80%～120%认为电泳结果可靠。将血清样本的TRPC含量归一化为100，获得相对定量血清IIRPCs的含量。每一例样本IIRPCs相对含量计算公式为待分析蛋白复合物条带光密度值除以该样本的TRPC光密度值。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)进行统计学分析。采用χ2检验比较各组间性别和临床资料差异，用完全随机方差分析或独立样本t检验比较各组间年龄差异。实验中各组间差异采用One-way ANOVA的Bonferroni进行两两比较。所有检验均为双边检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用Pearson及Spearman法进行相关性分析。采用受试者工作特性曲线(receiver operator characteristic curve,ROC curve)分析各指标对预测疾病活动度的效力，并划分最佳阈值分数。

2 结果

2.1 一般情况69例UC患者中，男43例，女26例，男女比例为1.7∶1，中位年龄45岁(20～73岁)，其中12例处于缓解期，57例处于活动期(轻度活动期6例，中度活动期29例，重度活动期22例)。67例CD患者中，男45例，女22例，男女比例为2∶1，中位年龄32岁(17～59岁)，其中缓解期30例，中度活动期25例，重度活动期5例，另7例CD患者资料不全，未进行活动度评估。处于缓解期和活动期患者的年龄、男性所占比例差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

基于血清IIRPCs，所有样本可分为四类：类型a、b、c和其他类型，其中a型包括a1、a2、a3、a4，4个IIRPCs，b型包括b1、b2、b3、b4、b5，5个IIRPCs，c型为空白型，不含IIRPCs。a型和b型血清IIRPCs见图1。UC患者中a型36例，b型27例，c型6例；CD患者中a型26例，b型28例，c型8例，其他类型5例。由于其他类型样本数目较少，且条带a1、b1与上方无意义条带距离较近，定量时容易受到干扰，后续仅对a型(a2～a4)和b型(b2～b5)IIRPCs进行定量分析。

2.2 UC患者实验室指标、IIRPCs与疾病活动度关系活动期UC患者较缓解期UC患者白蛋白(ALB)水平下降，血小板(PLT)、血沉(ESR)和hsCRP水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。活动期患者IIRPCs水平较缓解期升高，其中中度活动期b型的b2、b4、b5水平与缓解期相比，差异有统计学意义(P<0.05)。重度活动期a型的a3及b型的b2、b5水平与缓解期相比，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。b2、b5对UC疾病活动度评估的ROC曲线下面积分别为0.826、0.859，略高于HGB、PLT、ESR、hsCRP。各指标对UC疾病活动度评估的价值详见表2。

图1 a型与b型IIRPCs Native-PAGE电泳结果

表1 缓解期和活动期UC患者实验室指标及IIRPCs比较Tab 1 Comparison of laboratory markers and IIRPCs in patients with UC during remission and active stage

注：P值为活动期组与缓解期组比较，IIRPCs值为相应条带与TRPC比值×100。

表2 实验室指标及IIRPCs判断UC临床疾病活动度的价值Tab 2 Value of laboratory markers and IRPPCs in judging disease activity of UC patients

2.3 CD患者实验室指标、IIRPCs与疾病活动度关系对于CD患者，活动期较缓解期HGB、ALB水平下降，PLT、ESR水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。活动期IIRPCs水平较缓解期呈升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。各实验室指标对CD疾病活动度评估的价值见表4。

2.4 IIRPCs与临床常用炎症指标的关联性分析在UC患者中，以含量较高的a3和b4为例，分析IIRPCs含量是否与临床常用炎症指标，如ESR、hsCRP存在相关性。统计研究a3与ESR及hsCRP，b4与ESR及hsCRP的相关性，结果显示,a3与ESR、a3与hsCRP、b4与ESR呈正相关(见图2)。

3 讨论

蛋白质是生物体功能的直接执行者，但并非单个蛋白质或几个蛋白质去完成一系列生理功能，通常，蛋白质在体内与蛋白质或其他分子相互作用，形成蛋白质复合物，通过复合物执行各项生理功能。血液所包含的蛋白质与生物体的功能执行及疾病的发生、发展有很强的关联性，伴随着蛋白质分离、纯化和鉴定技术的成熟，通过比较正常和不同疾病状态下的蛋白质的变化，寻找疾病标志物已成为新的研究热点。与单一蛋白质相比，蛋白质复合物作为疾病标志物有着更贴近生理状态的优点，同时也降低了对蛋白质分离程度的要求，有着更为广阔的应用前景。我们前期研究中首次将蛋白复合物用于IBD的研究，使用简单的Native-PAGE电泳发现并证实了IBD患者血清IIRPCs水平较健康对照明显升高，IIRPCs能够作为高灵敏性的IBD诊断生物标志物。本研究进一步发现，IIRPCs与IBD疾病活动度相关，活动期IBD患者血清IIRPCs水平较缓解期升高。b2>56.4评估UC活动的灵敏性和特异性分别为73.9%和100%，b5>67.2评估UC活动的灵敏性和特异性分别为82.6%和100%，两者ROC曲线下面积高于HGB、PLT、ESR、hsCRP。

表3 缓解期和活动期CD患者实验室指标及IIRPCs比较Tab 3 Comparison of laboratory markers and IIRPCs in patients with CD during remission and active stage

注：P值为活动期与缓解期组间比较，IIRPCs值为相应条带与TRPC比值×100。

表4 实验室指标评估CD疾病活动度的价值Tab 4 Value of laboratory markers in judging disease activity of CD patients

图2 相关性分析 A：UC患者a3与ESR相关性分析(r=0.576，P<0.001)；B：UC患者a3与hsCRP相关性分析(r=0.392，P=0.020);C:UC患者b4与ESR相关性分析(r=0.426，P=0.027)；D：UC患者b4与hsCRP相关性分析(r=0.375，P=0.054)Fig 2 Correlation analysis A: correlation analysis between a3 and ESR in UC patients (r=0.576，P<0.001); B: correlation analysis between a3 and hsCRP in UC patients (r=0.392，P=0.020); C: correlation analysis between b4 and ESR in UC patients (r=0.426, P=0.027); D: correlation analysis between b4 and hsCRP in UC patients (r=0.375,P=0.054)

IIRPCs是血清中多种与炎症相关的蛋白分子由非共价键相互作用组成的蛋白复合物，主要成分包括补体因子H，补体C3、C4、C7组分，触珠蛋白，免疫球蛋白α、γ、κ组分，载脂蛋白，转铁蛋白等，大多与免疫、炎症和补体系统有关。补体系统不仅能够帮助机体检测和清除细菌，而且在维持肠道免疫稳态中起关键作用。研究表明，葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium salt,DSS)诱导的慢性结肠炎小鼠模型中结肠黏膜C3蛋白表达增加，提示Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)-C3轴可能在肠道免疫应答中发挥作用[9]。儿童IBD患者的研究提示，补体C4基因数与炎症水平呈正相关，其机制可能为C4B基因拷贝数增加，补体系统对微生物的反应增强，从而加剧了IBD相关的微生态菌群失调[10]。触珠蛋白是一种具有免疫调节特性的血红蛋白结合蛋白，其基因(16q22)具有两个不同等位基因：触珠蛋白1和触珠蛋白2。通过检测不同人群的触珠蛋白[4]基因型，发现CD和UC患者Hp2基因型出现率较高，提示触珠蛋白基因可能参与IBD易感性[11]。

传统的炎症生物学标志物，如CRP、ESR、PLT、PCT等，因检测简易快速、无创安全等优势在临床中普遍使用，但因受全身因素的影响波动较大，灵敏性和特异性欠佳，不能准确评估IBD活动度[12]。目前已有多项研究表明，活动期IBD患者与缓解期IBD患者血清蛋白质组存在差异。KANMURA等[13]使用蛋白芯片系统发现活动期UC患者血浆人中性粒细胞肽1-3(human neutrophil peptides 1-3, HNP 1-3)水平较缓解期UC患者、CD患者、感染性肠炎患者显著升高，可作为UC活动的指标。国外有研究表明，活动期CD患者血清触珠蛋白水平升高，且与CDAI评分具有较好的一致性[14]。本研究发现，IIRPCs与IBD疾病疾病活动度相关，无论UC还是CD患者，活动期患者血清IIRPCs水平较缓解期升高，且IIRPCs含量与ESR、hsCRP均呈正相关。血清蛋白质组有望成为IBD疾病活动度评估的新方法。

本研究具有一定的局限性。首先，研究样本量偏小，尤其是重度CD患者数目较少，虽活动期CD患者血清IIRPCs水平较缓解期呈升高趋势，但差异无统计学意义。且本研究非前瞻性研究，有待在更大规模的样本中进行验证。其次，本研究未对蛋白复合物进行进一步分离和精确鉴定，同样的蛋白复合物在不同疾病中各组分比例、蛋白糖基化修饰可能不同。下一步可增加样本量，进一步分析活动期与缓解期IBD患者血清IIRPCs中不同组分的比例、糖基化修饰等的差异，进一步探索IIRPCs在IBD研究中的应用价值。

本研究证实，可利用简单的Native-PAGE方法，分离疾病相关的血清IIRPCs。IIRPCs与IBD疾病活动度相关，活动期IBD患者血清IIRPCs水平较缓解期升高，且IIRPCs含量与传统炎症指标ESR、hsCRP均呈正相关。关于IIRPCs的进一步研究，将会给发掘更佳的生物学标志物提供方向。