文物蛋白胶料的气相色谱-质谱分析方法探讨

王子铭，王丽琴，马珍珍，杨 璐

(1.西北大学文化遗产学院，陕西 西安 710069；2.文化遗产研究与保护技术教育部重点实验室，陕西 西安 710069)

中国古代所使用的胶结材料主要是天然化合物，如鸡蛋、动物胶(骨皮、乳汁、血液)及植物胶等，该类物质易降解、老化，给分析鉴定工作带来了挑战。目前，文物蛋白胶结材料(以下简称“胶料”)的分析方法主要有氨基酸分析法[1]、红外光谱法[2-4]、拉曼光谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[8-9]等。氨基酸分析法能检测蛋白质水解后生成的单一氨基酸，测定胶料中氨基酸总量，但需要样品量较大[10]；红外光谱和拉曼光谱同属振动光谱，与色谱技术相比，检出限较高[6]，但红外光谱法只能通过特征峰鉴别含有多糖和蛋白质的胶结材料，难以细分胶料种类[2]。色谱法是常见的有机物分析方法，其中液相色谱法具有优异的重现性，适用于不易气化或受热易分解的样品。但测定文物蛋白胶料时，由于氨基酸本身在紫外区吸收很弱，荧光性质也较差，需先将其衍生为紫外吸收较强或有荧光性质的物质以便测试[11]。与液相色谱法相比，气相色谱法更适于分析易气化的样品，具有较高的分离效能和灵敏度[12]，气相色谱与质谱联用后，在具有高效分离性能的基础上，兼具特异鉴别能力[13]，这对测量复杂的文物样品体系十分重要。

国内外学者已利用GC-MS鉴定文物中的多种胶结材料。Guttmann等[14]使用GC-MS鉴别了19世纪特兰西瓦尼亚玻璃绘画中的胶结材料及其降解产物，其中鸡蛋、动物胶、牛奶(酪蛋白)和亚麻籽油广泛应用，部分样品使用了松香和多糖类物质；在古罗马壁画胶结材料中，植物蜡、十字花科植物油及松香等植物提取物比动物胶更受偏爱[15]。GC-MS分析结合光学显微镜观察能用于壁画工艺研究。例如，Tomasini等[16]采用该技术确定玻利维亚圣母玛利亚教堂的壁画是先用动物胶涂在石膏层上打底，然后将鸡蛋和亚麻籽油与颜料混合的绘制工艺。但GC-MS鉴定蛋白胶料的方法学研究在国内外仍为空白。本研究拟探讨文物蛋白胶料的气相色谱-质谱分析方法，测定丙氨酸、甘氨酸等11种氨基酸的精密度和检出限，并应用于文物蛋白胶料的鉴定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司产品，配有电子轰击离子源(EI)及数据处理系统；MSD-8G微波消解仪：上海新仪微波化学科技公司产品；KQ-500E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；LXJ-ⅡB离心机：上海安亭科学仪器厂产品；QYN100-2氮气吹扫仪：上海乔跃电子有限公司产品；Master-S Hitech-Sciencetool实验室超纯水系统：上海和泰仪器有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

AAS18混合氨基酸标准溶液(包含L-丙氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸，浓度均为2.5 mmol/L)，L-羟脯氨酸(简称Hyp)，内标氨基酸为L-正亮氨酸(简称Nor)，衍生化试剂为N-(叔丁基二甲硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(简称MTBSTFA)+1%特丁基二甲基氯代硅烷：均为美国Sigma-Aldrich公司产品；氨水、吡啶：色谱纯，天津市光复精细化工研究所产品；三乙胺：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；高纯氦气(纯度99.999%)：四川梅塞尔气体产品有限公司产品；盐酸：优级纯，四川西陇化工有限公司产品；实验用水：Master-S Hitech-Sciencetool实验室超纯水。

猪皮胶：按照古代动物胶的制作工艺制成[17]；全蛋和牛奶：均为市售鸡蛋和牛奶。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：HP MS-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：100 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至280 ℃，并保持至所有待测物全部流出；载气(He)流速1.5 mL/min。

1.3.2质谱条件 电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃。

1.4 实验方法

1.4.1标准曲线 (1) 样品配制：以水为溶剂将上述AAS18混合氨基酸标准溶液稀释10倍，溶液中所分析的11种氨基酸浓度为0.25 mmol/L，该溶液简称为“混标”。分别取适量Hyp和Nor粉末，用水配制成1.25 mmol/L Hyp溶液，80 μg/g Nor溶液备用。(2) 取样、加内标：共选择8个浓度点，取1、3、5、7、9、11、13、15 μL(混标和Hyp溶液各1 μL，以下同)，分别加入5 μL 80 μg/g Nor内标，氮气吹扫仪吹干。(3) 衍生化处理：在每个吹干后的样品中，分别加入40 μL吡啶、10 μL衍生化试剂、2 μL三乙胺，放入烘箱中，于65 ℃下衍生30 min。(4) GC-MS测试：吸取2 μL样品，手动进样，按照1.3节条件进行测试，平行测量6次。

1.4.2检出限 (1) 萃取：加1 200 μL 2.5 mol/L氨水溶液于样品瓶中，置于超声波仪中萃取1.5 h，重复2次，将离心得到的上层萃取液于氮气保护下吹干。(2) 净化：采用固相萃取C4柱进行样品净化，方法同文献[18]。(3) 水解：微波辅助盐酸法水解蛋白质。在步骤(2)的样品瓶中加入2滴6 mol/L HCl，置于加有10 mL 6 mol/L HCl的消解罐中，充入氮气并立即旋紧消解罐盖子，于微波消解仪中进行水解。微波水解条件为：在500 W功率下，100 ℃加热15 min后升温至160 ℃，加热30 min。(4) 衍生化处理：取出样品瓶，冷却降温后加入5 μL 80 μg/g Nor内标，并于氮气保护下吹干。衍生化处理方法同1.4.1节中的步骤(3)。(5) GC-MS测试：方法同1.4.1节中的步骤(4)，平行测量12次。

1.4.3现代参考胶料的分析检测 分别取猪皮胶、全蛋和牛奶胶料各5 mg，实验方法同1.4.2节，仅在步骤(1)中加5 mg现代参考胶料，平行测量10次。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线及线性范围

以校正峰面积(y)和浓度(x，μg/g)绘制11种氨基酸的标准曲线，并求得相关系数和线性范围，结果列于表1。可知，11种氨基酸的线性关系良好，除羟脯氨酸的稳定性略差外，其余氨基酸标准曲线方程的相关系数均大于0.99。

表1 11种氨基酸的标准曲线方程、线性范围及检出限Table 1 Linear equations, linearity ranges and limits of detection of 11 amino acids

图1 猪皮胶(a)、全蛋(b)和牛奶(c)的GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of pigskin glue (a), egg (b) and milk (c)

2.2 精密度

按照1.4.1节方法，混标进样量11 μL(n=6)时，11种氨基酸的相对标准偏差(RSD)在2.7%～6.3%范围内。丝氨酸、羟脯氨酸由于分子结构中含有羟基，不稳定，易被氧化[19]，导致RSD>5%，其他9种氨基酸的RSD均不超过5%。

2.3 检出限

仪器检出限是指在规定的条件下，当仪器处于稳定状态时，仪器本身存在的噪音引起测量读数的漂移和波动，其物理含义是在一定的置信范围内能与仪器噪音相区别的最小检测信号对应的待测物质的量。

根据表1中各氨基酸标准曲线方程，以截距为0的曲线方程式计算求得空白样品中每种氨基酸浓度、标准偏差及检出限DL，其中DL计算公式如下[20]：

式中：k为置信因子；S为空白样品响应值的标准偏差；b为截距为0时标准曲线的斜率(也称“仪器灵敏度”)。取k=3，置信概率为99.7%。

由表1可知，甘氨酸的检出限最低，为0.066 μg/g；亮氨酸的检出限最高，为0.676 μg/g。

2.4 现代参考胶料的分析检测

猪皮胶、全蛋和牛奶3种现代参考胶料的GC-MS谱图示于图1。由图可见，3种现代参考胶料中的11种氨基酸在该色谱条件下完全分离，峰型基本呈高斯分布，基线平稳。由表1标准曲线方程求得10次测量的氨基酸含量归一化结果的平均值，结果列于表2。由表2可见，3种胶料的氨基酸含量具有特征性，猪皮胶含有的羟脯氨酸是动物胶的特征标志物，可以同牛奶、全蛋相区分。

表2 现代参考胶料和文物样品的氨基酸含量归一化结果Table 2 Relative amino acid molar percentage contents of reference samples and cultural relic

2.5 文物蛋白胶料的鉴定

依据本研究建立的方法对广西服饰金线文物样品进行分析，结果列于表2。由表2可知，文物样品中含有羟脯氨酸，说明胶料中含有动物胶。使用SPSS软件对文物样品和2.4节中现代参考胶料的氨基酸含量进行主成分分析(简称PCA)，结果表明，前两个主成分Factor 1和Factor 2的累计贡献率达到95.58%，说明这两个成分可以较好地表征原数据的信息。前两个主成分的因子得分散点图和主成分因子载荷矩阵图分别示于图2和图3。

图2 前两个主成分的因子得分散点图Fig.2 Scatter scores plots of the first two factors

由图2可知，猪皮胶、全蛋、牛奶3种现代参考胶料在PCA图上各自呈明显的聚类效应，猪皮胶位于Factor 1轴负值方向，全蛋和牛奶位于Factor 1轴正值方向，利用Factor 1的差异可将猪皮胶与全蛋、牛奶区分；全蛋和牛奶分别位于Factor 2轴的正、负值方向，利用Factor 2的差异可将全蛋与牛奶区分，实现3类胶料的鉴别。3类胶料产生这种聚类效应的原因可由图3和表2解释：高含量的羟脯氨酸和甘氨酸会导致向Factor 1轴负向移动，高含量的亮氨酸、谷氨酸会导致向Factor 1轴正向移动；结合表2，猪皮胶含有羟脯氨酸(9.33%)、高甘氨酸(31.74%)、低亮氨酸(4.32%)和低谷氨酸(11.19%)，全蛋、牛奶不含羟脯氨酸，含有低甘氨酸(5.58%、2.84%)、高亮氨酸(11.88%、12.58%)和高谷氨酸(18.59%、27.67%)，导致猪皮胶和全蛋、牛奶分别位于Factor 1轴的正、负方向。同理，全蛋的高丝氨酸和天冬氨酸、牛奶的高谷氨酸含量，导致两者分别处于Factor 2轴的正负方向。根据图2，推测文物样品成分为动物胶和蛋类的混合胶。

图3 主成分因子载荷矩阵图Fig.3 Load matrix plot of principal component factor

3 结论

本研究探讨了文物蛋白胶料的气相色谱-质谱分析方法，结果表明，现代参考胶料中常见的丙氨酸、甘氨酸等11种氨基酸标准曲线的线性关系良好，其中10种氨基酸曲线的相关系数大于0.99，相对标准偏差在2.7%～6.3%之间，检出限范围为0.066～0.676 μg/g。气相色谱-质谱分析结合主成分分析鉴定出广西服饰金线文物样品的胶料为动物胶和蛋类的混合胶。该方法适用于文物蛋白胶料的定量分析，可为GC-MS分析蛋白胶结材料提供方法参考。