头发氢稳定同位素比值检测的标准品选择研究

刘昌景，梅宏成，朱 军，何 亚，何欣龙，蒋 敬，权养科，王桂强

(1.公安部物证鉴定中心，北京 100038；2.南京森林警察学院，南京 210023；3.国家林业局森林公安司法鉴定中心，南京 210023；4.中国人民公安大学刑事科学技术学院，北京 100038)

近年来，稳定同位素比值质谱分析技术(stable isotope ratio mass spectrometry, IRMS)广泛应用于农产品溯源[1]、动植物生态学[2]、环境学[3]等多个领域，并尝试运用在公安侦查及法庭科学研究中，以期获得人的生活时空信息[4]。大量科学研究表明，人类与动物体内的碳、氮、硫同位素取决于他们摄取的食物，但是这3种同位素都很难反映地域关系。相比较而言，氢、氧同位素代表着水源，能较好地反映地域关系。头发角蛋白中的氢同位素比值是毛囊中一系列合成作用的结果，包括饮水、饮食和空气中的氢来源，所以根据头发长度和相应的生长时间，可部分反映出研究对象几周甚至几年内的活动轨迹[5]，这对公安侦查破案具有重大意义。

在稳定同位素比值质谱中，样品的稳定同位素比值是相对于工作气体进行测量的。测得的比值必须在各自的国际稳定同位素参考比例尺上进行转换才可以进行实验室间比对。这种数据转换过程通常称为同位素数据归一化或同位素数据校正[2]。现有的同位素真值校正方法[6]主要有：1) 单点标定法(single-point anchoring)，单一利用工作参比气，或者利用单个标准品的δ值进行倍率换算；2) 两点校正法(two-point normalization)，利用两个标准品的测量δ值和真值之间的差别，绘制线性曲线进行换算；3) 多点校正法(multiple-point normalization)，基于两点校正法改良，用于绘制标准曲线的标准品多于两个。单点标定法因其单一性和缺少参照性逐渐不被采纳；两点校正法具有两个标准品，互为参照，较单点校正法更严谨，然而当两点均出现偏差时则无纠错能力；多点校正法被广为采纳，大多采用3个标准品，以其测量值为自变量，真值为因变量进行曲线拟合，绘制标准曲线，当3个标准品的测量值精确度和真实性均较高时，标准曲线的R2趋近1，且可以识别出随机误差，相比两点法更为准确[6-7]。但是在多点校正法中，选择不同的标准品会造成标准曲线的差异，进而导致校正后的真值不同。因此，对于同一种物质/样品，选择统一的标准品和真值校正算法，可获得准确性和重现性较高的同位素测定值。在同位素质谱分析中，检测头发中的氢同位素相比于碳、氮同位素有更多技术难点，如空气中交换氢的影响[8]、标准品选择的局限性和不同校正方法带来的误差[9]，这些都会影响头发中氢同位素的测量精度。已有文献全面讨论了如何消除样品中氢与空气氢的交换影响[10]，但尚未有对人头发中氢同位素比值测量的标准品选择和真值校正的系统分析。

本研究针对质谱检测氢同位素如何选择合适的标准品、如何进行数据校正进行研究和探讨。实验拟选择USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMAP1和EMAP2 6种备选标准品，对其氢同位素进行多次测量，通过比较多点校正的真值校正算法，甄选出推荐的标准品组合，进行35多次反复验证(多实验室，时间跨度4个月)以确定其稳定性。本工作确定的标准品组合和校正算法对于提升不同实验室间测定人头发δ2H的可比对性和可溯源性具有重要意义，可为构建可供比对的全国头发氢稳定同位素比值数据库提供基本性准入标准。

1 实验部分

1.1 仪器与参数

实验仪器由EA-IRMS联机系统组成，包括253Plus稳定同位素比值质谱仪、Flash EA 2000型元素分析仪、ConFlo Ⅳ连续流接口装置，均为美国Thermo Fisher Scientific 公司产品。Flash EA 2000元素分析仪的载气流速设置为100 mL/min, 吹扫进样盘的吹扫气流速为200 mL/min，高温裂解炉的温度为1 380 ℃，色谱柱柱温80 ℃。

1.2 实验方法

1.2.1标准品备选评测 标准品选择的通用推荐标准[11-12]包括7个方面：1) 同位素测量时称样量较小；2) 稳定性和长期保质性；3) 易于操作和处理；4) 单一的纯化合物(更推荐)；5) 与待测样品自然组成相似；6) 比待测样品的稳定同位素比值更正或更负，囊括待测样品的极值；7) 测量稳定性高。根据以上标准，从现有相关文献[9,13-15]采用的标准品及氢稳定同位素比值检测常用的标准品中选择USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMA-P1和EMA-P2 6种进行评测，结果列于表1。

USGS42和USGS43满足上述标准第1、2、3、5、7点，特别是它们与待测样品自然组成相似原则，应是最符合本次实验需求的标准品。但USGS42与USGS43不满足第4和6点，即它们并非单一化合物，且不能囊括所有头发样本的极值，因此有必要对这6种标准品进行系统的数据分析。

1.2.2真值校正标准曲线比较 在现有的同位素真值校正方法中，多点线性校正法相比于两点线性校正法更严谨，极值范围更宽，故本实验甄选3种标准品，以其测量值为自变量，标准品真值为因变量进行直线拟合，进行三点校正法比对。

为获得较高的准确性，每次测量均重复3次，即连续放置3个同一待测样品。此外，为避免记忆效应[16]对测量值的干扰，间隔放置Empty或Blank进行测量，具体放样位置列于表2。基于多点校正法，选择3个标准品进行线性拟合，所选标准品应覆盖待测样品的范围。目前已测中国人头发样本300余人份(覆盖10个城市)，氢稳定同位素的δ2H值范围为-55‰～-80‰。比待测样品更负的极负值可选CBS(-157)或EMA-P2(-87.8)；极正值可选USGS43(-50.3)、KHS(-35.3)、EMA-P2(-25.3)；中间值为USGS42(-78.5)。因此，可囊括极负值、中间值和极正值绘制标准曲线的组合方式共有6种，即CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/EMA-P1、CBS/USGS42/KHS、EMA-P2/USGS42/USGS43、EMA-P2/USGS42/EMA-P1和EMA-P2/USGS42/KHS。通过4次重复验证实验，对比以上6种组合获得的标准曲线R2，以获得拟合度最高的标准曲线。

表1 待选标准品的同位素信息Table 1 Isotopic information of reference materials

注：结果均采用平均值±1SD‰表示

表2 待测标准品放样位置Table 2 Sequences of reference materials in autosampler position

1.2.3实验室间重复验证 为了考察选定的标准品及真值校正算法的普适性，选择上海某稳定同位素实验室进行重复实验。本实验建立的方法累计重复验证达35次，时间跨度为4个月。通过考查其R2来确定本方法选定的标准品及真值校正算法的适合性与稳定性。

2 结果与讨论

2.1 中国人头发氢稳定同位素比值(δ2H)检测标准品的适合性评估

依据现有文献推荐的方法对USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMA-P1和EMA-P2进行评估后发现，各标准品均具备测量需求量小、稳定性和长期保质性强、易于操作的特点。与头发样本自然成分接近的USGS42、USGS43、CBS和KHS均不是纯化学物质，而EMA-P1和EMA-P2虽符合纯化学物质属性，但与人头发自然属性不同。对比6种标准品的测量精确度，USGS42、USGS43、CBS和KHS在30次以上重复检测的标准差小于3‰，且精确程度较EMA-P1和EMA-P2高，结果列于表3。

2.2 中国人头发氢稳定同位素比值(δ2H)测量真值校正曲线论证

根据目前所得中国人头发δ2H值的大致范围为-55‰～-80‰，囊括其范围的极负值、中间值和极正值的6种组合为：CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/EMA-P1、CBS/USGS42 /KHS、EMA-P2/USGS42/USGS43、EMA-P2/USGS42/EMA-P1和EMA-P2/USGS42/KHS。这6种组合的δ2H真值多点线性拟合曲线示于图1。经比对可以发现，CBS/USGS42/KHS(图1a)、CBS/USGS42/USGS43(图1b)和CBS/USGS42/EMA-P1(图1c)组合的曲线拟合度较高，R2均超过0.99，其中以CBS/USGS42/USGS43(图1b)组合的曲线拟合度最高，R2为1。对比不同组合的校正曲线系数，CBS/USGS42/USGS43(图1b)最接近1，该系数越接近1代表测量值与真值校正转换越精确。

表3 待选标准品适合性评估Table 3 Evaluating the six reference materials for appropriateness

注：1.同位素测量时称样量较小；2.稳定性和长期保质性；3.易于操作和处理；4.单一的纯化合物(更推荐)；5.与待测样品自然组成相似；6.标准品的标准差[9, 15, 17]；7.标准品的重复检测次数[9, 15, 17]；8.是否为极值；“Y”代表“是”；“N”代表“否”

图1 不同标准品组合的δ2H真值多点线性拟合曲线(第一次实验)Fig.1 Multiple-point normalization method utilizing linear regression (δTrue=aδMeasured+b), established on six reference materials (the first test)

为进一步验证其准确性，对6种组合进行4次重复实验，结果显示，大部分组合的标准曲线均呈现不同程度的波动，以EMA-P2/USGS42/USGS43标准曲线的稳定性最差，且拟合度最低(R2=0.875 1±0.041 8)。有3种组合(CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/KHS和CBS/USGS42/EMA-P1)的标准曲线R2高于0.99，CBS/USGS42/USGS43标准曲线的4次重复所得R2均为1。校正曲线系数a方面，CBS/USGS42/USGS43组合(1.061 8±0.006 6)、CBS/USGS42/EMA-P1(0.957 0±0.018 9)和EMA-P2/USGS42/EMA-P1(0.922 1±0.029 7)的4次重复相较于其他组合的测量值校正系数均更接近1，其中CBS/USGS42/USGS43组合的标准差最小、稳定性最佳。根据标准曲线的拟合度和系数，选取稳定性和准确性最佳的组合，即CBS/USGS42/USGS43组合为中国人头发δ2H值检测的最适标准品，详细结果列于表4。

表4 不同标准品组合标准曲线(δTrue=aδMeasured+b)的R2值和校正系数aTable 4 R2 and coefficient a value of multiple-point normalization utilizing linear regression

2.3 中国人头发氢稳定同位素比值(δ2H)测量标准品及真值校正曲线的稳定性验证

选择CBS/USGS42/USGS43标准品组合及其多点线性校正曲线作为人头发氢稳定同位素比值检测和校正的推荐标准，必须保证该标准品组合和校正方法能够在不同实验室、不同时间得到高拟合度R2的重复验证。为了确证这一点，本研究历时4个月(2018年8月～2018年12月)在本实验室(北京)进行了33次重复实验，并在上海某稳定同位素实验室进行了2次重复实验。在33次重复实验中，拟合度R2均高于0.9997；上海某实验室2次重复实验的标准曲线拟合度R2均为1。因此，CBS/USGS42/USGS43标准品及其多点线性校正曲线可作为人头发氢稳定同位素测量的推荐标准方法，并可应用于全国人头发氢稳定同位素比值数据库的构建。

3 结论

水中氢稳定同位素在不同地域呈规律性分布，其地域性差异可通过生物代谢在人头发中得以体现，对于追溯人的生活时空信息具有重要价值。然而，固体氢稳定同位素的测量存在测定精确度较差、不同实验室数据比对重现性较低等问题，不利于构建可供比对的全国人头发稳定同位素比值的数据库。为了探索一套可推广的人头发氢稳定同位素比值测量的标准方法，本研究通过对比适合作为头发氢稳定同位素比值的6种标准品特性，根据实测的中国人头发δ2H范围值，对不同标准品组合的真值校正曲线进行了分析比对，确定了拟合度最高的CBS/USGS42/USGS43标准品组合，并进一步进行了跨实验室和时间段重复论证，均获得稳定结论。该方法可作为全国人头发氢稳定同位素比值数据库数据准入的推荐方法，甄选标准品和真值校正曲线的思路亦可为其他稳定同位素标准库的建立提供参考。

致谢：感谢赛默飞世尔科技(中国)有限公司上海研发中心稳定同位素实验室马潇工程师在仪器调试方面给予的技术支持，以及对本次验证实验研究中给予的帮助。