超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法分析葫芦巴成分

秦玉华，王君花，刘忠英

(1.海南热带海洋学院，海南 三亚 572022；2.海南省海洋食品工程技术研究中心，海南 三亚 572022；3.吉林大学药学院，吉林 长春 130021)

葫芦巴(Trigonellafoenum-graecum, L.)，别名苦豆、香豆子、香草，为豆科蝶形花亚科一年生草本植物。葫芦巴种子是我国传统中药，具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化等药用价值，已被多版《中国药典》收录。此外，葫芦巴还被广泛用于食品工业[1-2]。现代研究表明，葫芦巴的主要成分为糖类、蛋白质类、脂类、皂苷类、黄酮类、生物碱类和挥发性有机成分等，其中，含量最高的3类药效活性组分依次是多糖、皂苷和黄酮。目前，对葫芦巴中葫芦巴碱、多糖、挥发油等成分的研究较多[3-5]，而对黄酮和皂苷类化合物的报道较少。

研究中药化学成分的传统方法是用溶剂分配和柱色谱法将其逐一分离为单一化合物，然后采用化学方法对其结构进行鉴定，操作繁琐、分离效率和自动化程度低，且对微量组分的分离困难。高效液相色谱-质谱法具有高效、快速、灵敏等优点，可用于中药天然产物有效成分的定性、定量分析[6-7]。

有文献报道[8-10]，葫芦巴多糖的提取多采用水提取工艺，而黄酮和皂苷多采用高浓度的乙醇提取工艺。本实验室在前期研究中发现，与单组分比较，葫芦巴多糖、皂苷、黄酮3个组分配伍对糖尿病的治疗效果更好[11]。为此，本工作利用水提和醇提两种方法提取葫芦巴中的化学成分，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)技术分析提取物中的黄酮和皂苷类化合物，以期找到一种简便快速的提取工艺能将3种组分同时提取出来，为深入开展葫芦巴活性成分的提取和药效学研究奠定基础，同时为研究葫芦巴的药效物质基础和开发应用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Acquity UPLC液相色谱仪、SYNAPT G2-S HDMS 质谱仪：均为美国Waters公司产品；Unitary C18分析柱：华普新科技有限公司产品。

1.2 材料与试剂

葫芦巴种子：购自长春市医药药材供销公司，经吉林大学药学院王广树教授鉴定为葫芦巴种子；甲醇和乙酸：均为色谱纯，美国Fisher公司产品；超纯水：由Milli-Q系统制备；其他试剂均为色谱级。

1.3 实验方法

1.3.1溶液制备 葫芦巴醇提组分的制备：精密称取5 g葫芦巴粗粉，用10倍量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，减压抽滤，合并滤液、浓缩、冷冻干燥，得到葫芦巴醇提组分。

葫芦巴水提组分的制备：精密称取5 g葫芦巴粗粉，用50倍量的水在10 ℃冷浸提取3次，每次1 h，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液、浓缩。向溶液中加入95%乙醇至乙醇浓度为70%，边加边搅拌，静置过夜，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液、浓缩、冷冻干燥，得到葫芦巴除糖后的水提组分。

甘草苷内标溶液的制备：精密称取1 mg甘草苷标准品，用50%甲醇溶解并稀释至25 mg/L。

供试品溶液的制备：精密称取适量的葫芦巴醇提组分和除糖后的水提组分，用50%甲醇溶解，加入适量的甘草苷内标溶液，使醇提组分和水提组分供试品溶液的最终生药浓度为10 g/L，甘草苷内标物的最终浓度为5 mg/L，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2UPLC-MS和UPLC-MS/MS分析 色谱条件：Unitary C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；流动相：A为0.1%甲酸，B为乙腈；洗脱程序：0～5 min(10%～15%B)，5～10 min(15%B)，10～20 min(15%～20%B)，20～25 min(20%～23%B)，25～40 min(23%～24%B)，40～48 min(24%～25%B)，48～64 min(25%～40%B)，64～65 min(40%～55%B)，65～70 min(55%～60%B)，70～75 min(70%B)，75～80 min(70%～80%B)，80～85 min(80%～100%B)；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源 (ESI)；四极杆飞行时间串联质量分析器；负离子模式检测；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度250 ℃；锥孔气(N2)流速50 L/h；脱溶剂气(N2)流速为600 L/h；毛细管电压2.0 kV；锥孔电压60 V。

2 结果与讨论

2.1 葫芦巴醇提、水提组分化学成分的分析

采用UPLC-Q-TOF负离子模式分析加入甘草苷后的葫芦巴醇提组分和水提组分供试品溶液，得到的总离子流图示于图1。可见，内标化合物甘草苷的保留时间为24.25 min，位于化合物11和12之间。各化合物得到了较好的分离，两种供试品溶液的总离子流图相似，区别是保留时间75 min后，醇提组分的色谱峰比水提组分多，说明醇提组分中极性小的化合物比水提组分多。本研究共鉴定出36种化合物，包括12种黄酮类化合物和24种皂苷类化合物，具体信息列于表1。

2.2 黄酮类化合物结构鉴定

葫芦巴黄酮的主要苷元为芹菜素(apigenin, api)和木犀草素(luteolin, lut)。以芹菜素为苷元的黄酮，其特征碎片为m/z383[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120-90)、m/z353[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120-120)；以木犀草素为苷元的黄酮，其特征碎片为m/z357[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-90)、m/z327[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120)。葫芦巴黄酮糖苷主要连接在6位和8位上，易发生糖环内部裂解，糖环内部裂解碎片丢失具有一定的规律性，组成糖链的单糖分为戊糖(木糖、阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)，戊糖出现60、90 u碎片丢失；己糖出现60、90、120 u碎片丢失[12-13]，其中鼠李糖出现74、104 u碎片丢失，结合准分子离子峰，有助于快速发现和鉴定碳苷类化合物。此外，结合相关文献[14-15]，可根据碎片离子的相对丰度强弱，推测黄酮类化合物中糖苷的位置：如准分子离子m/z563的碎片离子峰m/z473相对丰度明显强于碎片离子峰m/z443时，可推测戊糖连接在6位C上；准分子离子m/z447的碎片离子峰m/z327相对丰度明显强于碎片离子峰m/z357时，可推测己糖连接在8位C上。

葫芦巴黄酮准分子离子峰主要包括m/z593、563、557、461、431、447，其中含有大量的同分异构体，由于缺少对照品，仅鉴定了苷元的类型、糖的类型及糖苷位置，尚不能确定其具体结构。通过分析黄酮类化合物在MS2模式下的碎片离子，并查阅相关文献[15-18]，本实验最终鉴定出11种黄酮类化合物的结构，示于图2。第12个推测为类黄酮类化合物(槲皮素类化合物)，因其双键位置不确定，未列于图2中。

图1 葫芦巴加入甘草苷后，醇提组分(a)和水提组分(b)的总离子流图Fig.1 Chromatograms of ethanol extract (a) and water extract (b) after sugar removal with liquiritin of fenugreek

准分子离子为m/z593、563、557、431的葫芦巴黄酮类成分均出现了m/z383、353碎片离子，由此判断它们的苷元为芹菜素。以化合物3为例，其碎片离子为m/z593、503、473、383、353，出现了两次90、120 u中性丢失，即发生两次糖环内部裂解，表明其含有2个己糖，分别连接在6位和8位C上，其质谱图示于图3。结合参考文献[12]，最终确定化合物3为芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷。

准分子离子峰m/z563出现了m/z503、473、443、383、353碎片离子，中性丢失依次为60、90、120 u，推测其含有1个戊糖和1个己糖结构；准分子离子峰m/z577出现了m/z503碎片离子，中性丢失为74 u，推测其含有鼠李糖结构；准分子离子峰m/z431先后发生中性丢失90、120 u，推测其含有1个己糖结构。

化合物7、8均出现准分子离子峰m/z447，碎片离子为m/z357[M-H-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-90)、m/z327[M-H-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH]-(M-H-120)，确定化合物7和8的苷元为芹菜素。以化合物8为例，其MS/MS碎片离子m/z327的相对丰度明显强于m/z357，推测己糖连接在8位C上，最终鉴定该化合物为木犀草素-8-C-己糖苷，其中己糖苷为葡萄糖或半乳糖，示于图4。

2.3 皂苷类化合物结构鉴定

葫芦巴皂苷为甾体皂苷，包括呋喃皂苷、螺甾皂苷，苷元种类丰富。通常以一对非对映异构体(C-25S和C-25R)的形式存在，在ODS柱上S构型的皂苷较R构型出峰早，由此可判断一对非对映异构体的构型[19]。葡萄糖、鼠李糖、木糖构成了糖苷，其连接在3位和26位羟基上，裂解时糖环依次整个脱落，由中性丢失顺序可推断糖基连接顺序，同时，通常将最后1个丢失的糖基归于26位羟基。

通过分析UPLC-Q-TOF MS/MS模式下的碎片离子和保留时间，并结合参考文献[19-21]，推断皂苷中的糖基数量、单糖类型、连接位点、C-25S/R构型以及苷元类型等，最终鉴定出24种皂苷类化合物，结构示于图5。

图2 葫芦巴中黄酮类成分的化学结构Fig.2 Chemical structures of flavonoids in fenugreek

图3 化合物3的MS(a)和MS/MS(b)质谱图Fig.3 MS (a) and MS/MS (b) spectraof compound 3

图4 化合物8的MS(a)和MS/MS(b)谱图Fig.4 MS (a) and MS/MS (b) spectraof compound 8

以化合物13为例，其MS/MS谱图示于图6。在MS模式下，出现准分子离子峰m/z905及碎片离子峰m/z951[M+HCO2H]-，MS2模式下出现碎片离子m/z773[M-132]-、m/z611[M-132-162]-、m/z449[M-132-162-162]-，推测其先后失去1分子木糖、1分子葡萄糖、1分子葡萄糖，最后1个葡萄糖通常连接在C-26羟基上。此外，根据R/S构型异构体在ODS柱上的出峰特点，即25S构型的化合物出峰早于25R构型的化合物，最终确定该皂苷为葫芦巴皂苷Ia:25(S)-5α-呋甾-2α, 3β, 22,26-四醇,3-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 乙醇提取物和水提物主要成分的相对含量分析

分别向乙醇提取物和水提物的供试品溶液中加入甘草苷标准品溶液，使两种提取物溶液的最终生药浓度为10.0 g/L，甘草苷的最终浓度为5.0 mg/L。以甘草苷的峰面积为标准，将两种提取物溶液中主要化合物的峰面积与甘草苷峰面积对比，得到各化合物的相对峰面积值，列于表1。从表1可以看出，与水提物相比，乙醇提取物中化合物5、10、11的相对含量明显较高，其他黄酮类化合物的相对含量没有明显变化；乙醇提取物中黄酮类化合物的相对含量之和是水提物中的1.13倍，乙醇提取物中皂苷类化合物相对含量之和是水提物中的1.32倍。

图5 葫芦巴中皂苷类成分的结构式Fig.5 Chemical structures of saponins in fenugreek

图6 化合物13的MS(a)和MS/MS(b)质谱图Fig.6 MS (a) and MS/MS (b) spectra of compound 13

3 结论

本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对葫芦巴醇提物和水提物中的黄酮和皂苷类化合物进行定性分析，并以甘草苷为内标，对黄酮和皂苷类化合物进行半定量分析。定性分析共鉴定出36种化合物，包括12种黄酮类化合物，24种皂苷类化合物。以代表性的黄酮类和皂苷类化合物为例，对其结构进行了详细阐述。基于目前标准品种类的限制，其他黄酮和皂苷类化合物的结构有待进一步研究。葫芦巴经水提取，除得到多糖外，还可以得到黄酮和皂苷类化合物，但水提物中黄酮和皂苷的含量低于醇提物。该结果可为葫芦巴降血糖药物的开发和药效物质基础研究、以及质量控制标准的制订提供理论依据。