整合素αvβ3 在人工受精奶牛受孕前后表达规律研究*

谢云浩，王彦平，王相国，倪和民，麻柱**，郭勇，付博凡，杨佐君**

（1.北京农学院动物科学技术学院 北京 102206；2.北京奶牛中心 北京 100020）

整合素αvβ3 是一种异二聚体的跨膜糖蛋白，可表达于多种细胞类型，分布较广泛[1]，主要功能是结合配体，介导细胞之间、细胞与细胞外间质之间的相互作用，包括细胞黏附、信号传导、炎症反应、血液凝集、肿瘤血管生成等过程。相关研究证明，整合素αvβ3 在胚胎着床过程中对子宫内膜容受态的建立有着积极作用[2]。之前有学者提出在人的临床中整合素αvβ3 与其配体的检测可对子宫的容受态和非容受态进行鉴别[3-5]。近年来在牛、羊、猪等动物的早期妊娠研究中也检测到了整合素对子宫容受态建立的积极意义[6,7]。子宫容受态的建立与否是妊娠成功的重要影响因素，妊娠失败多发生在该阶段[8-10]，因此在该阶段进行妊娠成功的检测十分有意义。

目前，奶牛妊娠检测常用直肠触诊法、超声波检查法等临床诊断法和孕酮、早期妊娠因子等免疫诊断方法[11]。以上检测方法在检测对象、检测成本、操作难度和对检测对象的伤害等方面表现优劣各异，但最早准确检测的窗口时间为输精后的第28d[12,13]。牛胚胎着床过程中子宫容受态建立发生在输精后第10～20d，整合素αvβ3 有可能在这段时间发生mRNA 水平表达量的变化[14,15]。如果将受孕率与整合素αvβ3 在mRNA 水平的表达量建立联系，有可能把奶牛早期妊娠的检测窗口提前到第10～20d。通过血液中整合素αvβ3 的表达变化检测早期妊娠结果可以提前对妊娠奶牛进行必要的保胎措施[16]，对未受孕的奶牛采取二次输精，或将屡配不孕奶牛淘汰，降低饲养与护理成本[17]，因此早孕检测窗口期提前是提高配种效率的有效手段[14]。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器设备 荧光定量PCR 仪：Eppendorf，AG 22331 hanburg；电热恒温干燥箱：上海一恒科技仪器有限公司，DHG-9075A；低温离心机：Backman Coultek，AllegraTM64R Centrifuge；微量紫外分光检测系统：Alphaspec Innotech,Alpha SpecTM；手掌离心机：Bratt；制胶架：北京百晶生物技术有限公司；震荡恒温箱：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，HZQ-X100；酶联免疫检测仪：美国BIO-RAD 公司；-80℃超低温冰箱：日本三洋电机株式会社；电泳仪电源：北京百晶生物技术有限公司，power 600i；电热恒温水槽：上海森信实验设备有限公司，DK-8D 型。

1.1.2 试 验 试 剂 TRLzol®Reagent 总RNA 提 取 试 剂：Invitrogen USA LTD，200mL/ 瓶；M-MLV RT5×Buffer：PromegaBiotech (Beijing) Co.；dNTP Mixture：TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co.，2.5mmol each；UltraSYBR Mixture (High ROX)：北京康为世纪生物科技有限公司，5mL/盒；DEPC Treated Water (RNase Free)：TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.；PVDF 膜：Millipper 公司；甲叉双丙烯酰胺：美国SAN LAND 公司；5×蛋白上样缓冲液：北京康为世纪生物科技有限公司；过硫酸铵、Tween-20、SDS：北京定国生物有限公司；全血总蛋白提取试剂盒：上海贝博生物科技有限公司，BB-319617；β-actin、αv、β3 一抗，二抗：北京嘉暄智瑞生物科技有限公司。

1.2 样品选取与采血方法

北京地区某标准化奶牛场，选取10 头荷斯坦雌性奶牛。这些牛要求为：2016 年出生，体重相似，本次受孕均为第二胎，无生殖疾病及其他疾病，使用同期发情技术，确保输精日期为同一天，并在输精后继续跟踪观察奶牛的受孕情况。

使用5mL 注射器并更换9 号针头，牛尾根部10cm 凹陷处采血，注射入抗凝管中备用。

1.3 引物设计与处理

通过NCBI 查找相关基因的CDs 序列，并通过primer 3.0对引物序列进行设计，随后引物通过BLAST 系统和前期实验证明引物的特异性和扩增效率符合试验要求，并确定引物。确定后将引物序列交予生工生物工程（上海）股份有限公司由其代为合成，具体信息见表1。

将原装引物进行3,000r/min 离心1min，按照说明添加ddH2O，确保最终摩尔浓度为25μmol/mL，震荡混匀后进行分装，常用4℃保存，备用-20℃保存。

1.4 Trizol 法提取RNA 与反转录

匀浆处理：取1mL 冻存牛全血加入3mL 红细胞裂解液静置10min，10,000r/min 离心1min 收集白细胞沉淀。分层：加入500μL Trizol 后室温静置5min，加入200μL 氯仿剧烈震荡后静置3min。RNA 沉淀：4℃ 12,000r/min 离心10min 后，将400μL转移水相加入400μL 冰乙醇室温10min，4℃ 12,000r/min 离心10min 弃上清，RNA 沉淀于管底。RNA 漂洗：RNA 沉淀中加入75%乙醇温和震荡，4℃ 6,000r/min 离心1min，吸弃上清室温晾干。溶解RNA：加入50μL RNase-free water 轻弹管壁充分溶解RNA。测定RNA 质量浓度：设置微量紫外分光检测系统OD 比值为260/280，单位μg/μL 进行质量浓度测定。合成cDNA：分别加入1μg 体积的RNA、1μL Oligo d(T)18 Primer、4μL M-MLV RT 5×Buffer、2μL dNTP Mixture、1μL M-MLV Reverse Transcriptase、1μL Recombinant Rnase Inhibitor (RRI)，最终使用DEPC Treated Water 加至20μL。

1.5 荧光定量PCR

下载Step one 2.3 软件并正确安装。将引物原液使用ddH2O 进行稀释。PCR 使用50μL 反应体系，25μL 2×UltraSYBR Mixture(High ROX)、1μL Forward Primer，10HM、1μL Reverse Primer，10HM、2μL Template DNA、ddH2O 加至50μL。加样完成使用手掌离心机离心15s 确保管壁无液滴，液面下无气泡。提前15min 打开荧光定量PCR 仪进行预热。PCR 反应程序设定：预变性95℃ 10min，变性、退火、延伸分别为95℃ 10s、59℃ 30s、72℃ 32s，并循环40 次，第三阶段95℃ 15s、60℃ 1min、95℃15s、60℃ 15s。拷贝数据，进行处理。

1.6 Western blot

1.6.1 提取血浆蛋白每500μL 蛋白提取液加入2μL 蛋白酶抑制剂混合物和2μL 蛋白稳定剂，混合后置于冰上备用；取300μL 全血样品，加入300μL 蛋白提取液，充分混匀后，在4℃条件下震荡10min；将离心柱内柱套上套管，将提取液吸入离心柱内，在4℃条件下10000r/min 离心4min；收集套管内液体及全血总蛋白，可-80℃保存；将所得总蛋白使用ddH2O 稀释100 倍。

表1 引物序列

1.6.2 BCA 蛋白浓度测定 配工作液，试剂A:试剂B=50:1；待测蛋白每孔加10μL 和200μL BCA 工作液，做3 组平行；37℃培养30min；使用酶标仪在562nm 波长处测定；绘制标准曲线并计算浓度值；使用1×蛋白上样缓冲液调平。

1.6.3 Western blot 分析 配制SDS-PAGE 分离胶，沿边加入，用水压平，凝固后将水倒出，滤纸吸干；配制SDS-PAGE 浓缩胶，插入梳子，用枪加满，凝固后放入电泳槽，添加电泳液，4℃静置过夜；加样，两端buffer，左侧Marker，每孔加入30μL，浓缩胶100V 20min，分离胶150V 40min；转膜，将PVDF 膜甲醛浸泡10min，以黑板-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-白板对应放好避免气泡，250mA 2h；封闭，将PVDF 膜浸于5%脱脂牛奶的PBST 溶液中，摇床40r/min 2h；一抗0.4μg/mL 孵育，PBST 浸泡3 次，每次摇床40r/min 5min，裁剪PVDF 膜一抗4℃过夜；二抗0.4μg/mL 孵育，PBST 浸泡3 次，每次摇床40r/min 5min，二抗摇床40r/min 孵育2h；HRP-ECL 发光鉴定，PBST浸泡4 次，每次摇床40r/min 10min，避光添加ECL 至于蛋白曝光仪；拷取数据，进行处理。

1.7 统计方法

数据通过Excel 2017 和SPSS 22.0 等软件进行处理。试验结果使用平均数±标准差进行表示，使用t 检验差异显著性分析的方法，*表示两组数据间差异显著，**为差异极显著（P ＜0.05）。

2 结果

2.1 奶牛受孕检测结果

在输精后第40d 使用直肠触诊法进行受孕检测，所选取的10 头荷斯坦奶牛7 头受孕，3 头未受孕。

2.2 受孕奶牛血液αv 基因相对表达量

αv 基因在受孕奶牛中表达结果如图1 所示。结果显示在输精后的第13 和16d 时αv 基因表达量同比第10d 明显升高，同时第16天表达量更高，而第19天时有较明显降低，但仍有所表达。

2.3 未受孕奶牛血液αv 基因相对表达量

αv 基因在未受孕奶牛中表达结果如图2 所示。结果显示同比第10d，第13d αv 基因表达量无增加趋势，第16 和19d αv基因表达量同比第10d 明显下降。

2.4 受孕奶牛血液β3 基因相对表达量

β3 基因在受孕奶牛中表达结果如图3 所示，结果显示在输精后的第13、16 和19d 时β3 基因表达量同比第10d 明显升高，同时第16d 表达量最高，虽然第19d 呈下降趋势，但β3 基因表达量仍高于输精后第10d。

2.5 未受孕奶牛血液 β3 基因相对表达量

β3 基因在未受孕奶牛中表达结果如图4 所示。结果显示在输精后的第13d 时β3 基因表达量同比第10d 明显升高，第16d表达量迅速减少并明显低于第10d，虽然第19d 有所回升，但β3 基因表达量仍低于输精后第10d。

2.6 αv 与β3 蛋白在受孕与未受孕奶牛中的表达差异

αv 与β3 在蛋白质表达水平WB 检测结果如图5 所示。显示

在受孕奶牛血浆中输精后第16d 时αv 与β3 蛋白质表达相比较明显升高，而未受孕奶牛血浆中的αv 与β3 蛋白质表达在输精后。

3 讨论

本试验结果显示，输精后第16d 时αv 基因和β3 基因表达量与奶牛受孕结果相关，即高表达量的奶牛在后期统计中显示为受孕奶牛，而低表达量奶牛在后期的统计中显示为未受孕奶牛。在观察受孕奶牛αv 基因和β3 基因表达量变化中发现，受孕奶牛在输精后第10、13 和16d 呈现上升趋势，αv 基因相对温和，而β3 基因升高较快，第19d 时αv 基因和β3 基因表达量均快速下降；未受孕奶牛的αv 基因和β3 基因表达量在输精后第13d同比受孕奶牛的表达量增加缓慢或者不增加，第16d 时更是出现显著降低，且远低于第10d，第19d 有所回升但回升不明显。通过Western blot 试验得出αv 与β3 在蛋白质水平的表达趋势基本与其在mRNA 水平一致；此结果与Chisei Tei 等在人整合素αvβ3 表达量与受孕结果关系的研究结果相似[18]。本试验结果可初步证明荷斯坦奶牛在受孕过程中整合素αvβ3发挥着重要作用，是影响早期妊娠的重要因子，输精后第16d 其mRNA 表达水平与受孕结果相关。

本试验因受样本采集量、取样时间间隔、奶牛品种及养殖环境差异等因素影响可能存在一定的局限性[19,20]，将在后续试验中进一步完善。为有效避免其他影响早期妊娠的不利因素加强变量控制，试验所选用的奶牛均为受孕第二胎次，因此本研究结果是否适用于其它胎次还有待后续试验进一步证明。

目前奶牛业妊娠检测常用检查法的最早检测窗口在输精后第28d[21]。本试验的目的是希望建立αvβ3 在mRNA 表达水平与受孕结果之间的联系，筛选出可检测的早期妊娠关联因子，为奶牛怀孕检测窗口期的提前提供理论基础。本试验结果将有可能使荷斯坦奶牛的妊娠检测窗口期提前到输精后的第16d，如应用于生产将有效降低繁殖成本，提高奶牛养殖业经济效益。