除膻菌株的功能性分析

李秋桐，苏伟，母应春

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

膻味是羊肉具有的一种不良风味，人们对羊肉的膻味进行了大量研究，发现这种特征风味物质主要来源于羊肉的脂肪组织[1]。8 个～10 个碳原子的不饱和脂肪酸对羊肉的风味影响很大，尤其是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸是形成羊肉膻味的主要脂肪酸[2]。微生物除膻是一种较好的除膻方法，通过将菌株接种到羊肉中，微生物产生的脂肪酶与羊肉中的脂肪酸产生作用，对羊肉的风味起到改善作用，一定程度上降低了羊肉的膻味[3]。传统的方法中，采用添加橄榄油和指示剂的平板对脂肪酶产生菌进行分离筛选。通过对培养基进行改良，将橄榄油替换成羊油，将乳化后的羊油和荧光指示剂加入到筛选平板中，筛选出4 株能酶解羊油的霉菌，经鉴定分别为微孢根霉（Rhizopus microsporus），米根霉（Rhizopus oryzae），米曲霉（Aspergillus oryzae）和多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）。并通过液态发酵试验，发现这4 株霉菌对4-甲基辛酸和4-乙基辛酸均具有降解作用，可以用于羊肉除膻。

在菌种发酵的过程中，一些微生物会产生H2S、生物胺，赋予产品不好的感官品质[4-5]。H2S 是一种急性剧毒，吸入少量高浓度的H2S 即可使人于短时间内致命，即使是低浓度的H2S 也会对眼睛、呼吸系统及中枢神经造成影响[6]。人体摄入过量的生物胺会引起中毒，表现出头疼、心悸、呕吐、血压变化和呼吸紊乱等严重反应，除此之外尸胺、腐胺、精胺和亚精胺等与亚硝酸盐反应能产生致癌物质亚硝基胺[7]。发酵肉制品在制作过程中，大都会添加一定量的食盐和亚硝酸盐，起到调味和防腐的双重功效。当食盐及亚硝酸盐达到一定浓度时，会对微生物产生透胁迫及毒性作用，使微生物受到抑制甚至死亡[8]。因此筛选出的菌株应对盐类具有一定的耐受能力。

本试验对分离筛选出的4 株霉菌进行功能性分析，包括脂肪酶活性的测定、产H2S 测定试验、产生物胺测定试验和抑菌试验，并对其耐盐性、耐硝酸盐性及生长曲线进行测定，进一步筛选出合适的菌株进行拮抗试验和复配试验，为后续菌株应用于羊肉发酵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微孢根霉（Rhizopus microsporus）TZH1、米根霉（Rhizopus oryzae）TZH3、米曲霉 （Aspergillus oryzae）TZH4、多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）4QT3、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：贵州大学畜产品加工实验室。

NaOH、酚酞（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；橄榄油（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；Na2HPO4·12H2O、FeCl2（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；KH2PO4、溴甲酚紫（分析纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；95%酒精（分析纯）：天津市富宇精细化有限公司；NaCl（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；NaNO2（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；磷酸吡哆醛、硫胺素、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增的全套试剂和扩增引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。

液体发酵培养基[9-10]：蛋白胨20.0 g、蔗糖5.0 g、（NH4）2SO41.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO41.0 g、羊油 10.0 g（用2%聚乙烯醇乳化，羊油与聚乙烯醇按质量比1 ∶4、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌 20 min。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯浸粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g、氯霉素 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose both，PDB）培养基：马铃薯浸粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、氯霉素0.1 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌 20 min。

H2S 测定培养基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、琼脂 20.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌20 min；FeCl2溶液：将FeCl2晶体先溶解在较浓盐酸中，然后再用蒸馏水稀释，再加入少量铁粉；在琼脂凝固前，将等量的FeCl2溶液在无菌条件下注入试管中，待其冷却凝固即可接种菌株。

生物胺测定培养基[11]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、K2HPO42.0 g、CaCO30.1 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌20 min；无菌条件下加入硫胺素0.01 g、磷酸吡哆醛0.05 mg、溴甲酚紫0.05 g。

耐盐测试培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaCl 80.0 g、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌 20 min。

耐亚硝酸盐测试培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaNO2150.0 mg、蒸馏水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-100SII 立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电热恒温培养箱（DPH-420）：天津天泰仪器有限公司；电子天平（FA2004N）：上海青海仪器有限公司；全温摇瓶柜（HYG-A）：苏州培英实验设备有限公司；超声波细胞粉碎机（BILON88-II）：上海比郎仪器制造有限公司；离心机（TGL20M）：长沙边佳森仪器设备有限公司；恒温水浴箱（DK-98-II）：天津泰斯特仪器有限公司；紫外可见光光度计（756S）：上海棱光技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

无菌条件下，分别将TZH1、TZH3、TZH4 和4QT3这4 株霉菌接种于配制好的PDB 培养基中，30 ℃下培养72 h，制成4 株霉菌的种子菌液。

1.3.2 脂肪酶活力的测定

将菌株的种子菌液接种到液体发酵培养基中，接种量为5%，30 ℃下180 r/min 培养72 h。培养完毕后，取发酵液于4 ℃，8 000 r/min 离心15 min，上清液即为粗酶液，用于测定脂肪酶活力[12]。

取两个150 mL 的三角瓶，记为为空白组和样品组。分别向两组三角瓶中加入4.0 mL 乳化橄榄油底物溶液和5.0 mL 缓冲液，再于空白组中加入95%的酒精15.00 mL，于40 ℃下水浴中预热5 min，然后各自加入1.0 mL 酶液充分混匀，反应15 min 后立即向样品组中加入95%的酒精15.00 mL 使反应终止，取出[13]。

向两组三角瓶中分别滴入两滴酚酞指示剂，用0.05 mol/L 的NaOH 标准溶液进行滴定，至微红色并在30 s 后不褪色为滴定终点，记录NaOH 标准溶液消耗体积并计算。脂肪酶活力的计算公式如下：

式中：X 为样品的酶活力，U/g；V1为滴定样品组时消耗NaOH 标准溶液的体积数，mL；V2为滴定空白组时消耗 NaOH 标准溶液的体积数，mL；c 为 NaOH 标准溶液浓度，mol/L；n1为样品的稀释倍数。

1.3.3 生长曲线的测定

分别将菌株以2%的接种量接种于PDB 培养基中，30 ℃下培养，每隔2 h 取菌液测定600 nm 下的OD值，取至36 h，绘制菌株的生长曲线图。

1.3.4 产H2S 及产生物胺测定试验

将FeCl2溶液注入到试管中，待琼脂冷却凝固后，用移液枪分别吸取4 种菌液各50 μL，插入到琼脂中进行接种，30 ℃下培育7 d，观察琼脂是否变成黑色，若变为黑色则说明该菌株产H2S 记为阳性，不变黑色记为阴性，每株菌做2 个平行试验[14]。

无菌条件下，称取1%的赖氨酸、酪氨酸和精氨酸混合氨基酸，添加到生物胺测定培养基中，混匀，对照组培养基中不添加氨基酸。分别将菌株接种到生物胺培养基中，30 ℃下培养3 d，观察颜色变化，若由黄色变为紫色则说明该菌株产氨基酸脱羧酶记为阳性，反之记为阴性[15]。

1.3.5 抑菌试验

以大肠杆菌和葡萄球菌作为指示菌。各挑取一环保藏在甘油中的大肠杆菌和葡萄球菌，在平板上划线活化2 代后，用无菌生理盐水制成浓度为107cfu/mL的菌悬液。用移液枪分别吸取200 μL 的指示菌菌悬液于PDA 培养基中，用涂布棒涂布均匀，静置5 min。随后用6 mm 的无菌打孔器在培养基上打孔。分别取4株菌株的菌液各 50 μL，4 ℃下 8 000 r/min 冷冻离心15 min，加入到培养基孔中，30 ℃下培养48 h。观察孔周围是否出现抑菌圈，并记录出现的抑菌圈直径，每株菌做2 个平行试验[14]。

1.3.6 耐盐性及耐亚硝酸盐性试验

将菌株分别接种于含8%NaCl 的耐盐测试培养基中，对照组不接种菌液，30 ℃下培养72 h，测定600 nm处的OD 值，每组样品测定3个平行，并计算“对照组OD 值/样品组 OD 值”的比值[16]。

将菌株分别接种于含0.015%NaNO2的耐亚硝酸盐培养基中，对照组不接种菌液，30 ℃下培养72 h，测定600 nm 处的OD 值，每组样品测定3 个平行，并计算“对照组 OD 值/样品组 OD 值”的比值。

1.3.7 菌株的拮抗试验与复配试验

通过上述试验筛选出2 株合适的菌株，将菌株在PDA 培养基上交叉划Z 线，30 ℃下培养72 h 后，观察是否均有菌落生长，划线的交叉处是否出现相互抑制生长的现象，若无该现象则说明这2 株菌不具有措抗作用[17]。

将 2 株菌的种子液按 1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1 的体积比分别接种于新的PDB 培养基中，30 ℃下培养，在培养12、24、36、48、60、72 h 时取菌液测定 600 nm 处的 OD值，同时测定pH 值。

2 结果与分析

2.1 脂肪酶活力的测定试验

在相同条件下对菌株进行培养，脂肪酶活力测定结果如图1所示。

图1 菌株产脂肪酶活力Fig.1 Strains producing lipase activity

如图1所示，THZ1 的酶活力最高为（4.35±0.02）U/mL，其次 TZH4 的酶活力为（3.62±0.05）U/mL，4QT3 的酶活力为（2.63±0.04）U/mL，TZH3 的酶活力为（2.34±0.02）U/mL。菌株TZH1 的酶活力显著高于其他3 株菌（P＜0.05）。

发酵肉制品在风味形成的过程中，脂类物质起着重要的作用，而脂肪酶能催化脂类物质的反应，有利于风味物质的形成。于华等[18]从四川腊肉中分离获得一株产脂肪酶能力较强的霉菌，在其最适产酶条件下脂肪酶活力可达384.05 U/100 mL。姚晓蕾[19]采用脂肪酶对猪肉进行酶解，发现其挥发性分为物质有明显的增加，包括硫化物、有机硫化物、芳香类化合物及含乙醇类物质等。因此菌株的脂肪酶活力越高，越能形成发酵肉制品中的优良风味。

2.2 菌株的生长曲线

4 株菌的生长活性曲线如图2所示。

图2 株菌株的生长曲线Fig.2 Growth curves of 4 strains

4 株菌的生长趋势相似，其中0 h～8 h 为迟缓期，8 h～18 h 为对数期，18 h～26 h 为稳定期，26 h～36 h 为衰亡期。可以看出菌株TZH4 的生长活性较强，其余3株的生长活性相似。

2.3 产H2S和产生物胺测定试验

4 株菌株进行产H2S 和产生物胺测定试验结果如表1所示。

表1 菌株产H2S 产生物胺测定结果Table 1 Results of determination of amines produced by strains producing H2S

产 H2S 测定试验中，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3的琼脂均无变黑现象，因此这4 株菌均不产生H2S。产H2S 测定试验中，4QT3 的培养基由黄色变为紫色，其余不变色，因此菌株4QT3 产生物胺，其余3 株菌不产生生物胺。

H2S 是一种有毒物质，不仅影响食品的口味，而且还对人体有害，它被称为是人体神经的毒剂，是窒息和刺激性较强的危害性气体[20]。H2S 能与肉品中的还原性血红蛋白作用生成紫红色硫化血红色蛋白，进一步氧化形成绿色[21]。生物胺普遍存在于各种发酵食品，在生物细胞中具有重要的生理功能，但当人体吸收过量的生物胺时，可能会引起头痛、心悸、血压变化等过敏性反应[22]。某些微生物则会在充足的生物胺前体物（氨基酸）、具有氨基酸脱羧酶活性以及适合的生长繁殖等条件下产生生物胺[23]。因此筛选用于发酵肉制品的菌株，不得产生H2S 和生物胺。

2.4 抑菌试验

4 株菌株进行抑菌试验的结果见表2所示。

表2 菌株的抑菌能力Table 2 Antibacterial ability of the strain

如表2所示，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3 对大肠杆菌的抑菌圈分别为 11.5、18.0、22.5、11.0 mm，TZH1、TZH3、TZH4 和4QT3 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为 11.0、21.5、19.5、14.5 mm。抑菌圈越大，说明抑菌能力越强。

由金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7 等细菌性食物中毒引起的疾病在我国约占食品安全事件的30%～90%，也是世界范围内的主要公共卫生问题[24]。致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌通常引起腹部痉挛、水性或血性腹泻、发烧、恶心和呕吐等中毒症状，常出现在畜禽肉、水产品、奶、蛋等食品中。可以看出，菌株TZH3 和TZH4 的抑菌能力较强，能更好地抑制有害微生物的生长。

2.5 耐盐性和耐亚硝酸盐性试验

4 株菌株进行耐盐性验和耐亚硝酸盐性试验的结果如图3所示。

如图3所示，耐盐性试验中，TZH1、TZH3、TZH4和 4QT3 的“对照组 OD 值/样品组 OD 值”比值分别为1.55、8.57、9.75、2.27。菌株 TZH3 的比值显著高于其他3 株菌（P＜0.05），比值越大，说明耐盐性越强。耐亚硝酸盐性试验中，TZH1、TZH3、TZH4 和 4QT3 的“对照组OD 值/样品组 OD 值”比值分别为 1.26、2.61、3.58、1.17。菌株TZH3 的比值显著高于其他 3 株菌（P＜0.05），比值越大，说明耐亚硝酸盐性越强。

图3 菌株的耐盐性及耐亚硝酸盐性Fig.3 Salt tolerance and nitrite resistance of the strain

一般微生物细胞液的渗透压为0.85%NaCl 的等渗状态，微生物在等渗压的食盐溶液中代谢活动仍可正常进行，但当增加食盐时，食盐溶液的渗透压大于微生物细胞液的渗透压，当食盐的浓度达到13%以上时，可以完全抑制微生物的生长，包括乳酸菌以及大肠杆菌等[25]。当食盐及亚硝酸盐达到一定浓度时，会对微生物产生渗透胁迫及毒性作用，使微生物受到抑制甚至死亡[14]。而在发酵肉制品时，难免会用到NaCl 和NaNO2等腌制剂，因此所筛选出的菌株应当具有良好的耐盐性和耐亚硝酸盐性。可以看出，4 株菌中TZH3和TZH4 的耐盐性和耐亚硝酸盐性较好。

2.6 菌株的拮抗试验与复配试验

综合以上分析，最终选择TZH3 和TZH4 进行拮抗试验及复配试验。将菌株TZH3 和TZH4 在PDA 培养基上交叉划线培养后，发现均有菌落生长，并且在两株菌的交叉划线处均没有发现相互抑制的现象，说明菌株TZH3 和THZ4 不具有拮抗作用。

菌株THZ3 和 TZH4 复配试验的 OD 值和 pH 值如图4和图5所示。

图4 复配生长情况比较Fig.4 Comparison of compound growth

由图4、图5可以看出当TZH3 和TZH4 的复配体积比为 1 ∶1 时，生长情况较优，且在 48 h 时 OD 值达到最大值。而pH 值变化不大，说明3 种复配比的产酸能力相似。因此可选择TZH3 和TZH4 的复配体积比为1 ∶1 来对羊肉制品进行发酵。

图5 复配pH 值比较Fig.5 Comparison of compound pH values

3 结论

本试验将4 株具有除膻效果的霉菌进行了功能性分析，包括微孢根霉（Rhizopus microsporus）TZH1、米根霉（Rhizopus oryzae）TZH3、米曲霉（Aspergillus oryzae）TZH4、多枝横梗霉4QT3。通过脂肪酶活力测定试验、生长曲线的测定、产H2S 和产生物胺测定试验、抑菌试验、耐盐性和耐亚硝酸盐性试验、拮抗试验与复配试验，验证菌株安全性。结果表明，菌株TZH3 和TZH4安全性较好，适用于羊肉制品发酵。

近年来，国内许多学者将细菌或霉菌制成混合发酵制剂，接种到羊肉制品中。在发酵过程中，微生物产生的脂肪酶与羊肉中的脂肪酸产生作用，蛋白酶与蛋白质产生作用，对羊肉的风味及质构起到改善作用，一定程度上降低了羊肉的膻味[3]，为发酵制品提供特殊风味和色泽的同时又不会破坏羊肉的品质。现研究多采用直接购买的纯种菌株进行肉制品发酵，很少会筛选出具有特定功能性的菌株。菌株TZH3 和TZH4除了能够产生脂肪酶外，经试验验证还具有降解4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的功能，可以制成发酵剂应用于养肉制品发酵，开发新型羊肉制品并改善羊肉风味，对扩大羊肉消费市场具有重要的实现意义。