木姜子精油/壳聚糖/乳清蛋白复合膜对枇杷品质的影响

孟金明，樊爱萍，吴依婕，曾丽萍

（红河学院理学院，云南 蒙自 661199）

枇杷作为云南蒙自的特色水果之一，具有很高的观赏价值和经济价值。但是枇杷果实没有后熟作用，需在树上成熟后采收，且采摘后的枇杷易失水皱缩及受到机械伤害和病菌的侵染，很难进行长时间的贮藏和长距离运输，这制约了枇杷种植业的发展[1-2]。目前，常采用低温冷藏的技术延长枇杷的货架期，低温确实可以降低采后果实的呼吸，延长其贮藏时间，但由于枇杷果实具有低温敏感性，经冷藏后枇杷果肉木质化严重，质地生硬，口感严重下降，降低其食用价值[3-4]。因此，找到一种有效处理采后枇杷的方式，减缓贮藏过程中冷害的发生，是枇杷保鲜急需解决的问题之一。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的衍生物，无毒无害、可食用、可生物降解并具有良好的成膜性，是制作可食性包装材料的理想原料[5]。乳清蛋白是奶酪工业的副产物，具有良好的乳化性、凝胶性及成膜性，是制造可食性膜常用的材料[6]。将壳聚糖与乳清蛋白两种成膜材料进行复合可以弥补单一材料成膜后的一些物理性能上的缺陷，但是制成的复合膜在抑菌和抗氧化性能方面还存在缺陷。木姜子精油是从木姜子中提取得到的一种植物精油，具有抑菌效果、抗氧化性和对生物的趋避性等天然特性，在食品保鲜领域具有潜在应用价值[7]。本试验将制成的可食性膜液用于采后枇杷的涂膜保鲜，研究其对冷藏枇杷木质化及相关酶活性的影响，为采后枇杷的贮藏保鲜提供理论依据及实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为蒙自的大五星枇杷果实，选择无虫害、无机械损伤，大小均匀、成熟度一致的枇杷果实作为试验的材料。壳聚糖（脱乙酰度95%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乳清蛋白：美国Hilma 公司WPI9410；硫代巴比妥酸、盐酸羟胺、溴化乙酰、三氯乙酸、磷酸二氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、愈创木酚、氢氧化钠、磷酸均为分析纯（AR）：国药集团化学试剂有限公司。

T6 新世纪紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；XHF-D 型高速分散器：宁波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；TGL20M 型台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱：天津齐欣科学仪器有限公司；CP224C 型电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 复合膜液的制备

参照陈悦等[8]方法，略作修改。取一定量的壳聚糖溶于2%乙酸的溶液中，配制成浓度为1%的壳聚糖乙酸溶液，再称取一定量的乳清蛋白溶于去离子水中，配制成浓度为1%的乳清蛋白溶液，然后将两者按3 ∶1（体积比）的比例混合，然后添加一定量的木姜子精油，制得木姜子精油添加量为总固形物质量的0%、3%、6%、9%、12%的复合膜液。

1.2.2 枇杷涂膜保鲜处理

先把选取好的枇杷分成大小均匀的5 份，将枇杷分别置于不同木姜子精油浓度的膜液中浸泡1 min，取出后自然晾干，于8 ℃恒温恒湿箱下贮藏，每隔5 d 取样测定各项指标，每个指标重复测定3 次。

1.2.3 保鲜指标的测定

1.2.3.1 失重率

采用称量法测定[9]。

1.2.3.2 果实出汁率的测定

参照张瑜等[10]方法进行测定。

1.2.3.3 丙二醛（malondialdehyde，MDA）的测定

参照Pasquariello 等[11]方法进行测定，称取枇杷2.5 g，加 0.2 g 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），7.5mLpH=8.8 硼酸缓冲液，冰浴下研磨，4 000 r/min离心15 min，取上清液0.5 mL 酶液，加1.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸 （4，6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine，TBA）溶液（用20%的三氯乙酸配成），沸水浴20 min，迅速冷却然后12 000 r/min 离心10 min，取上液分别于450、532 nm 和 600 nm 处测定其 OD 值，计算如公式所示：

MDA 含量 （μmol·g-2）=[6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450]×V×（A/a）/W

式中：V 为提取液总量，mL；A 为反应液总量，mL；a 为测定提取液量，mL；W 为材料重，g。

1.2.3.4 木质素含量的测定

参照Morrison[12]的方法，称取4 g 果肉，加入5 mL 95%乙醇溶液冰浴研磨，在4 500 r/min 离心20 min，用95%的乙醇冲洗沉淀 3 次，再用乙醇-正己烷（1 ∶2，体积比）冲洗3 次，收集沉淀并干燥，将干燥物溶于25%溴化乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒温水浴30 min，加入1 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液终止反应，再加5 mL 冰醋酸和0.1 mL 盐酸羟胺，用冰醋酸定容至10 mL。在280 nm处测定样品提取液吸光值，结果以OD280nm/gFW 表示，测定3 次重复。

1.2.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的测定

参照詹嘉红等[13]方法测定PPO 活性，称取5 g 果肉加入5 mL 含2 g PVP 的磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 6.5），冰浴研磨，然后 4 ℃ 12 000 r/min 离心 20 min，取0.1 mL 上清液加入1.9 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液，1 mL 0.1 mol/L 的邻苯二酚溶液，在420 nm 下测定混合液3 min 内吸光度值的变化（每30 s 记录一次）。酶活性以每分钟吸光度值变化0.01 个单位为一个酶活单位，结果以U/gFW 表示，测定3 次重复。

1.2.3.6 过氧化物酶（peroxidase，POD）的测定

参照曹建康等[14]方法进行测定，酶液提取同PPO，取0.1 mL 酶液加入2.7 mL pH 6.5 0.2 mol/L 的磷酸缓冲液、0.1 mL 4 %的愈创木酚、0.1 mL 0.5 % H2O2。于470 nm 处测定10 min 内吸光度的变化值。酶活性以每分钟吸光度值变化0.01 个单位为一个酶活单位，结果以U/gFW 表示，测定3 次重复。

1.2.3.7 苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的测定

参照ZHAO 等[15]方法进行测定，称取2.5 g 果肉，加入 7.5 mL 含 0.2 g PVP 的硼酸缓冲液（pH 8.8），冰浴研磨，4 000 r/min 离心15 min，取0.2 mL 上清液加入3 mL 硼酸缓冲液（pH 8.8），0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸，37 ℃水浴加热1 h，于290 nm 处测定吸光值，酶活性以每分钟吸光度值变化0.001 个单位为一个酶活单位，结果以U/gFW 表示，测定3 次重复。

1.3 数据分析

采用Origin2017 软件进行数据的初步处理及作图，用SPSS Statistics 19.0 软件进行显著性分析，认为P＜0.05 时差异显著，试验结果用均值±标准差（±n，n=3）表示。

2 结果与分析

2.1 复合膜处理对冷藏枇杷果实出汁率的影响

随着贮藏时间的延长，枇杷表面及内部的水分不断散失，造成枇杷果皮皱缩不易剥离，可溶性果胶含量不断下降，果肉变硬和品质下降。复合膜处理对冷藏枇杷果实失重率和出汁率的影响见图1。

从图1a 可以看得出，随着贮藏时间的延长，枇杷果实的失重率不断升高，在整个贮藏期对照组的失水比较严重，果皮褶皱最为严重，而处理组的枇杷失重率明显低于对照组（P＜0.05），从感官上看果实的褶皱情况也明显好于对照组；从图1b 可以看得出，枇杷果实的出汁率随贮藏时间的延长不断降低，3%和6%处理组的枇杷出汁率明显要优于对照组和其他处理组。这可能是由于膜溶液在枇杷果实表面形成一层薄膜，产生一种微气调环境，抑制了其呼吸作用，从而减少了枇杷重量的损失[16]。随着木姜子精油添加量的继续增加，枇杷果实的出汁率下降，推测可能与药害[17]反应有关。

图1 复合膜处理对冷藏枇杷果实失重率和出汁率的影响Fig.1 Effect of composite membrane treatments on weight loss and juice percentage of loquat fruits during cold storage

2.2 复合膜处理对冷藏枇杷果实MDA含量的影响

MDA 就是膜脂过氧化的重要产物。它可以与蛋白质氨基酸残基或核酸反应生成西弗碱，破坏细胞完整性，降低膜的稳定性，促使果实衰老和腐烂。其含量是衡量果实细胞膜通透性的重要指标，间接反映了膜损伤的程度[18]。复合膜处理对冷藏枇杷果实MDA 含量的影响见图2。

图2 复合膜处理对冷藏枇杷果实MDA 含量的影响Fig.2 Effect of composite membrane treatments on MDA of loquat fruits during cold storage

从图2可以看出，随着贮藏时间的延长，枇杷果实中MDA 的含量持续增加。在贮藏前期MDA 含量增加较缓慢，到储藏后期15 d 以后，6%浓度的处理组果实MDA 含量显著低于对照组（P＜0.05），其他处理组的MDA 的含量也低于对照组。说明了涂膜处理能有效抑制膜脂过氧化作用，减少果实MDA 的含量。这可能是由于经过木姜子涂膜处理，枇杷果肉中清除自由基的酶活力增强，枇杷的膜脂过氧化作用受到抑制，MDA合成量降低，从而保护了细胞膜的完整性，有效保持冷藏枇杷的品质。

2.3 复合膜处理对冷藏枇杷果实木质素含量的影响

木质素为植物次生代谢的产物，是植物细胞壁的二级结构的主要成分，其含量的高低直接反映了果实的衰老程度，进而直接影响果实的质量[19]。枇杷发生冷害的最重要特征就是果肉木质素含量升高，果肉组织质地老化。复合膜处理对冷藏枇杷果实木质素含量的影响见图3。

图3 复合膜处理对冷藏枇杷果实木质素含量的影响Fig.3 Effect of composite membrane treatments on lignin of loquat fruits during cold storage

从图3中可以看出，在贮藏前期木质素的含量增加缓慢，随后增加迅速，在贮藏后期趋于平缓。枇杷果实木质素含量与木姜子精油浓度呈负相关关系，木姜子精油浓度越高，木质素水平越低，但当木姜子精油浓度达到一定水平后，增加木姜子精油浓度，枇杷果实木质素含量没有明显的降低。第10 天开始，3%和6%处理组木质素含量明显低于对照组（P＜0.05）且与这两个处理组之间不存在显著性差异。可见涂膜处理能够有效降低果实木质素含量，延缓了其老化进程，减缓了枇杷冷害的发生。

2.4 复合膜处理对冷藏枇杷果实PAL的影响

冷藏枇杷果肉组织中木质素的合成是一个复杂过程，是各种酶和非酶物质协同作用的结果，目前对催化木质素生物合成的酶类研究较多的是PPO、PAL、POD。木质素是植物苯丙烷代谢途径的主要终产物之一，PAL 是催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，PAL 可以作为木质化开始的标志酶[20]。低温条件下可以引起细胞壁物质代谢异常，PAL 活性上升，木质素和纤维素含量增多，导致果肉木质化败坏。复合膜处理对冷藏枇杷果实PAL 的影响见图4。

图4 复合膜处理对冷藏枇杷果实PAL 的影响Fig.4 Effect of composite membrane treatments on PAL activity of loquat fruits during cold storage

从图4可以看出所有试验组枇杷PAL 活性呈先上升后降低的趋势，在贮藏的第10 天到达最高值，但是6 %处理组PAL 活性峰值与对照组相比降低了24.65%，在贮藏的后期涂膜组的PAL 活性也低于对照组。说明用木姜子/壳聚糖涂膜处理，能有效的抑制PAL 活性，因为PAL 是枇杷木质化过程中的关键酶和限速酶，所以能在一定的程度上减缓枇杷在冷藏的过程中的木质化进程。

2.5 复合膜处理对冷藏枇杷果实POD的影响

POD 是促进木质素合成的关键酶之一，在木质素生物合成的最后一中POD 催化H2O2的分解，聚合木质素单体，促进组织木质素的合成，加速组织木质化过程并加速其衰老败坏[21]。复合膜处理对冷藏枇杷果实POD 含量的影响见图5。

图5 复合膜处理对冷藏枇杷果实POD 含量的影响Fig.5 Effect of composite membrane treatments on POD activity of loquat fruits during cold storage

从图5可以看得出，随着贮藏时间的延长枇杷果实POD 的活性呈现出先升高后缓慢降低的趋势，在贮藏的第10 天到达最高值，在贮藏的前15 天6%处理组POD 酶活性明显低于对照组（P＜0.05），在贮藏的后期3%和9%处理组POD 酶活性较低，两处理组POD活性差异不显著（P＞0.05）。说明用木姜子/壳聚糖涂膜处理，能有效的抑制POD 活性的增加，减少组织木质素的合成，减缓其木质化进程。

2.6 复合膜处理对冷藏枇杷果实PPO的影响

PPO 是酚类物质合成的一个关键酶。在PPO 的作用下，既可以将组织中的酚类氧化引起组织颜色变化，又可以催化香豆酸转化成咖啡酸，参与木质素的合成[22]。复合膜处理对冷藏枇杷果实PPO 的影响见图6。

图6 复合膜处理对冷藏枇杷果实PPO 的影响Fig.6 Effects of composite membrane treatments on PPO activity of loquat fruits during cold storage

从图6可知，随着贮藏时间的延长PPO 活性呈上升的趋势，在贮藏的前期，处理组PPO 活性与对照组差异不显著（P＞0.05），贮藏到10 d 后6%处理组PPO活性明显低于对照组两者存在显著性差异（P＜0.05），其PPO 活性总体低于其他处理组。说明用复合膜液涂膜处理，能有效的抑制PPO 活性的增加，一方面降低了枇杷果实褐变的程度，另一方面影响了组织木质素的合成，缓解低温对枇杷的影响，延长了货架期。

3 讨论与结论

植物精油是从植物的花、种子、茎、叶、根等部位萃取出来的，且具有芳香性和挥发性的一类油状液体物质，是植物体内的次生代谢产物，具有抑菌效果、抗氧化性和对生物的趋避性等天然特性[23]。近年来，国内外应用植物精油在果蔬保鲜方面的研究较多。纪雨薇等[24]研究枫香叶分离物对枇杷的贮藏保鲜效果，发现10 mg/100 mL 的枫香叶分离物可以有效控制枇杷果实腐烂指数、硬度、细胞膜渗透性及PAL 活性和POD 活性的升高，延缓可溶性固形物、可滴定酸含量的下降和木质素的积累。尚艳双等[25]研究枫香叶精油对低温贮藏枇杷的防腐保鲜效果，得出6 μL/100 mL的枫香叶精油处理可以显著延缓果实硬度上升和木质素的积累，减少果实腐烂、质量损失和丙二醛含量，减缓可溶性固形物的降低，抑制POD 和PAL 的活性。

本试验在8 ℃贮藏条件下，以未经涂膜的枇杷作为对照，探讨不同木姜子浓度的壳聚糖/乳清蛋白膜液对枇杷冷藏期间木质化的影响。试验结果表明木姜子精油（6%）/壳聚糖/乳清蛋白膜液涂膜处理枇杷果实可以明显降低其水分的散失，提升了其出汁率，维持果实的硬度，维持贮藏枇杷果实的品质；经过涂膜处理，枇杷果实MDA 的含量明显降低，枇杷的膜脂过氧化作用受到抑制，细胞膜的完整性得到保护，延长了枇杷的货架期。对于冷藏枇杷果实木质化影响的研究得出木姜子/壳聚糖涂膜处理可以明显抑制木质素合成相关的酶PPO、POD、PAL 的活性，进而减缓了其木质素的合成，降低了其木质素的含量，减缓贮藏过程中冷害的发生，延长了枇杷果实的货架期，使用6%浓度的木姜子壳聚糖乳清蛋白膜溶液处理组的结果要明显优于对照组及其他处理组。