清炒方式对西兰花异硫氰酸酯含量及活性的影响

朱叶，申雨珂，JOTHAME Mupunga，吴元锋，，毛建卫

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江 杭州 310023；2.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心（2011协同创新中心），浙江 杭州 310023）

西兰花又名花椰菜、青花菜，含有硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GSL）和内源性黑芥子酶等成分。在收割、切碎、咀嚼等过程中，GSL 可被黑芥子酶水解生成异硫氰酸酯（isothiocyanates，ITCs），其主要的水解产物有萝卜硫素（sulforaphane，SF）、芥酸（1-isothiocyanato-4-methylsulfanylbutane，ERN）、1-丁烯基-4-异硫氰酸酯（1-butene-4-isothiocyanate，BITC）等[1-2]。SF 能有效抑制前列腺癌、肝癌、直肠癌等癌细胞的生长和增殖[3-5]，此外SF 还具有预防Ⅱ型糖尿病、神经障碍、非酒精性脂肪肝等作用[6-8]。SF 具有上述功能主要是这种活性物能抑制I 型酶，刺激人体或动物细胞产生对机体有益的细胞醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase，NQO1）等Ⅱ型酶，诱导转录因子NF-E2 相关因子（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2），抑制转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）活性等功能[9-10]。其他的异硫氰酸酯，如ERN、苯乙基异硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate，PITC）、烯丙基异硫氰酸酯（allyl isothiocyanate，AITC）等也具有类似的活性[11-12]。

虽然SF 等物质具有上述活性，但是在烹饪后的蔬菜中含量较低，主要是由于黑芥子酶易失活。研究表明，不管用何种烹饪方法，都会降低黑芥子酶的活性[13-14]。作者研究表明，西兰花在微波加热4.8 min 后黑芥子酶即完全失去活性[15]。清炒是我国最常用的西兰花烹饪方法，经过清炒，西兰花的黑芥子酶也会失去活性，从而降低西兰花的ITCs 含量与营养学功效。本论文的主要目的是研究清炒方式对西兰花中SF 等ITCs 含量的影响，以期提高蔬菜中ITCs 的含量，以及研究不同清炒方式对西兰花提取物抑制小鼠黑色素瘤B16 细胞增殖、诱导B16 细胞NQO1 活性等方面的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西兰花：当地农贸市场；纯SF（纯度＞98%）、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）（纯度＞98%）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（纯度＞98%）、甲萘醌（纯度＞98%）、双香豆素（纯度＞98%）、葡萄糖-6-磷酸（纯度＞98%）、黄素腺嘌呤（flavin adenine，FAD）（纯度＞98%）（以上试剂均为分析纯）：美国sigma 公司；牛血清白蛋白、噻唑蓝、1，4-苯二硫醇（纯度＞95%）、1640 培养基、胎牛血清、蛋白质定量检测试剂盒：上海生工生物工程公司；B16细胞：上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M3 酶标仪：美国分子仪器公司；RE-200型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；EXF24086V超低温冰箱、PICO 高速离心机、BB150 CO2培养箱：美国 Thermo Fisher Scientific；A6-6BC 手持式高速匀浆机：上海殴和机械设备有限公司；G1701EA 气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；e2695 HPLC高效液相色谱仪：美国沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西兰花异硫氰酸酯等成分的酶解和提取

根据清炒条件，分为3 组：新鲜西兰花（RB）、直接炒西兰花（DS）以及先酶解后炒西兰花（HS）。RB 组：100 g 新鲜西兰花花蕾切碎，加入170 mL 的磷酸缓冲液和330 mL 的二氯甲烷，搅拌浸提2 h，真空抽滤，滤液分层后收集有机相，残渣和水相再用二氯甲烷抽提2 次，合并有机相，加入无水硫酸钠去除有机相的水分，旋转蒸干，25 mL 甲醇定容，保存备用。DS 组：电磁炉功率为1 200 W，预热1 min，100 g 西兰花花蕾切碎，立即倒入并充分翻炒4 min，立即置于冰水浴冷却，后续的提取步骤与RB 组相同；HS 组：100 g 西兰花切碎，放于37 ℃保温1 h，后续的清炒、提取步骤与DS 组相同。每组试验均重复3 次。将所得样品放于4 ℃冰箱保存待测。

1.3.2 总异硫氰酸酯含量测定

ITCs 总量按照文献[16]环缩合法分析，并稍作改进。样品与20 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH8.5）、10 mmol/L 1，4-苯二硫醇混匀，65 ℃保温2 h。反应结束后冷却到室温 25 ℃，再经 12 000 r/min 10 min，上清液经 0.22 μm微滤膜过滤。液相分析条件：流动性为80%甲醇、20%水，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长 365 nm。色谱柱为 4.6×250 mm i.d.，5 μm WondaCract ODS-2柱。以 1.25 μmol/L～10 μmol/L 浓度的萝卜硫素标准品绘制标准曲线。

1.3.3 气质联用分析异硫氰酸酯

西兰花水解产物的成分和含量通过气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）7890A GC 气质联用仪分析[17]。色谱柱为Hp-5MS的 UI 毛细管柱（0.25 μm，30 m×0.25 i.d.），进样量为1 μL，气化室温度为300 ℃。柱程序升温：50 ℃维持2 min，以 10 ℃/min 升至 190 ℃，再以 20 ℃/min 升至300 ℃，维持5 min。载气为超高纯氦，分流比为10 ∶1。质谱条件：接口温度220 ℃，电离方式为EI，电离能量为70 eV，质量范围为35 到500 amu。以环己酮为内标物。

1.3.4 噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法分别检测SF 和西兰花提取物对小鼠B16 细胞的抑制作用

SF 及西兰花提取物对小鼠B16 细胞的抑制作用采用噻唑蓝MTT 法检测[18]。取对数生长期的B16 细胞，用含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液进行消化，制备成单细胞悬液，接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，1×104个细胞/孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁，加入含有不同SF 浓度的培养液，使SF 最终浓度分别为 2.5、5、10、20、30 和 40 μmol/L，每个浓度设置5 个复孔；各组西兰花提取物稀释相同的倍数，使RB 组中ITCs 总浓度为20 μmol/L。另设两组对照组，空白对照组仅含有培养液，正常对照组含有不同SF 浓度的小鼠B16 细胞，多余的孔内加入无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。将加入药物的细胞放置37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养。24 h 后，在每个试验孔中加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的无菌MTT 溶液，继续孵育4 h，将试验孔中的培养液吸去，每孔加入150 μL 的二甲基亚砜溶解孔中的甲瓒。将96 孔板置于摇床避光振荡混匀10 min，检测570 nm处各孔的OD 值，计算不同浓度的SF 作用B16 细胞24 h 后的抑制率。每个试验均重复3 次。

1.3.5 SF 或西兰花提取物对B16 细胞中NQO1 活性的影响

取生长状态良好的小鼠B16 细胞接种于6 孔板，每孔 2 mL，5×105个/孔。待细胞贴壁后，加入 SF 和稀释倍数相同的西兰花提取物，使RB 组西兰花提取物中 ITCs 的含量为 20 μmol/L。6 孔板放入 CO2培养箱中培养24 h 后，去除每孔中旧的培养液，用无菌PBS洗3 次，加入含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的胰蛋白酶消化液消化。细胞悬液1 000 r/min 离心5 min，沉淀加入细胞裂解液、二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂体积比为200 ∶1 ∶2，用手持高速匀浆机高速剪切2 min，冰敷10 min，重复3 次，再于10 000 r/min 下离心 30 min，取上清液，分装于-80 ℃保存备用。

NQO1 的活性按照文献方法[19]测定。配制混合液（25 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，0.67 mg/mL 牛血清白蛋白，0.01% 吐温-20，0.02 mmol/LNADP+，1 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸，5 μmol/L 腺嘌呤黄素，2U 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，0.72 mmol/L MTT 和 50 μmol/L 甲萘醌），混合液与样品溶液按照体积比4 ∶1 混合。混合后在610 nm下每隔1 min 测定吸光度，连续测定5 min，最后加入25 μL 0.3 mmol/L 双香豆素终止反应，每隔1 min测定吸光度，连续测定5 次，以斜率计算MTT 的还原量。样品的蛋白含量通过蛋白质定量检测试剂盒测定，以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）为标准蛋白。NQO1 酶活性以（nmol 还原MTT/min/mg蛋白）表示。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 不同清炒方式对西兰花中各ITCs含量的影响

通过气质联用分析不同清炒方式对西兰花中各ITCs 含量的影响结果见图1。

结果表明提取物中主要含有SF、ERN、BITC，其中SF 的含量最高，其次是BITC，ERN 的含量最低。RB组和 HS 组中总 ITCs、SF、ERN、BITC 含量明显高于DS 组，RB 组中 ITCs 含量为（36.22±12.01）mg/100 mg，其中 SF、ERN、BITC 的含量分别为 （14.96±4.21）、（0.60±0.01）、（9.16±3.15）mg/100 mg；DS 组中 ITCs 含量为（10.64±2.41）mg/100 mg，SF、ERN、BITC 的含量分别为 （4.2±0.7）、0、（2.45±0.33）mg/100 mg；HS 组中ITCs 含量为（30.90±10.88）mg/100 mg，而 SF、ERN、BITC 的含量分别为（12.99±4.25）、（0.76±0.20）、（6.71±2.01）mg/100 mg。RB 组是新鲜西兰花，其水解液中SF、BITC 含量最高；HS 组水解液中总 ITCs、SF、ERN含量也明显高于DS 组，且RB 组和HS 组不存在显著性差异（P ＞ 0.05），HS 组和 DS 组间存在显著性差异（P ＜0.05），表明酶解后再清炒西兰花的ITCs 含量与新鲜西兰花相当。

图1 新鲜西兰花（RB）、直接炒西兰花（DS）和先酶解后炒西兰花（HS）中总 ITCs（A）、SF（B）、ERN（C）和 BITC（D）组分的含量Fig.1 The contents of total ITCs（A），SF（B），ERN（C）and BITC（D）in raw broccoli（RB），direct stir-fried broccoli（DS），hydrolyzed and stir-fried broccoli（HS）.

2.2 纯SF对B16细胞增殖的影响

以 MTT 法检测浓度为 2.5、5、10、20、30、40 μmol/L的纯SF 对B16 细胞抑制作用，结果见图2。

图2 SF 对B16 细胞生长的抑制率Fig.2 Proliferative inhibition of SF on B16 cells

由图2可知，B16 细胞的抑制率随着SF 浓度的增加而逐渐增大。20、30 μmol/L 和 40 μmol/L 浓度的 SF对 B16 细胞的抑制率分别为（39.72±1.66）%、（79.67±1.66）%和（96.92± 2.38）%，抑制效果较为显著，5、10、20 μmol/L 的 SF 对 B16 细胞的 24h 抑制率无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 西兰花提取物对B16细胞增殖的影响

由 2.2 可知，20 μmol/L 的 SF 对 B16 细胞有一定的抑制作用，因此将RB 组、HS 组和DS 组西兰花提取物稀释相同的倍数，使RB 组ITCs 的浓度为20 μmol/L，此时，HS 组 ITCs 的浓度为 17 μmol/L，DS组为6.57 μmol/L。将稀释好的各组西兰花提取物作用B16 细胞 24 h，并与 20 μmol/L 的纯 SF 结果做比较。结果见图3。

由图3可知，各组提取物对B16 细胞的生长都有一定的抑制作用，各组间不存在显著性差异（P ＞0.05），但是与纯SF 作用组相比均有显著差异（P ＜0.05）。

2.4 西兰花对B16细胞NQO1活性的影响

采用 20.00 μmol/L 的 SF 作用细胞，RB、DS 和 HS组也稀释相同倍数，使RB 组西兰花提取物中总ITCs浓度为 20.00 μmol/L，此时 HS 组 ITCs 的浓度为17.00 μmol/L，DS 组为 6.57 μmol/L，并与空白对照做比较（不添加西兰花提取液），结果见图4。

图3 西兰花提取物对B16 细胞生长的抑制Fig.3 Proliferative inhibition of broccoli extracts on B16 cells

图4 西兰花对B16 细胞NQO1 活性的影响Fig.4 Effects of broccoli extracts and SF on the NQO1 activity of B16 cells

由图4可知，20.00 μmol/L 的 SF 显著提高了NQO1的活性，对照组、SF、RB、DS、HS 各组细胞中的 NQO1的活性分别为（4.22±1.60）、（34.71± 4.03）、（19.53±3.59）、（12.58 ± 4.32）、（22.57 ± 3.56）（nmol 还原 MTT/min/mg 蛋白），其中SF 组与西兰花组存在显著性差异（P ＜ 0.05）；RB 组和 HS 组提取物对 NQO1 活性的影响较为显著，与 DS 组存在显著性差异（P ＜ 0.05），但是RB 组和 HS 组之间不存在显著性差异（P ＞ 0.05）。

3 讨论

SF 等ITCs 是通过黑芥子酶水解GLS 得到的[20]，黑芥子酶在烹饪过程中易失活，因此烹饪西兰花对ITCs 含量有很大的影响[15]。为了提高烹饪西兰花ITCs的含量，许多学者提出了有效的方法，如Ghawi 等[21]在烹饪后的西兰花中添加芥菜籽粉末，SF 的含量显著提高。熟的西兰花中添加萝卜根粉末，也得出类似的结论[22]。这是由于GLS 很稳定，烹饪过程中不会分解，通过添加含有黑芥子酶的芥菜籽或萝卜根粉末，可使GLS 酶解为ITCs。但这些方法的缺点是在西兰花中添加芥菜籽或萝卜根，可能会影响食物的口感。在本论文中，提出了一个新的方法，即把西兰花切碎并保温1 h，使GLS 被酶解为ITCs。ITCs 比黑芥子酶稳定，因此烹饪后仍然有较高的ITCs 含量。经过清炒后，尽管DS 组也有水解步骤，但此时内源性黑芥子酶已经失活，因此HS 组水解液中SF、ERN、BITC 等异硫氰酸酯的含量均比DS 高。Torres-Contreras 等[23]报道西兰花切碎后，其ITCs 的含量提高了133 %，这是由于切碎过程中GLS 即发生了酶解，提高了ITCs 的含量。本论文中，HS 组增加了酶解时间，ITCs 含量是DS 组的2.6 倍。

较高的ITCs 含量意味着较好的活性，因此，本论文又分析了不同清炒方式的西兰花提取物对B16 细胞抑制率和NQO1 活性的影响，并与纯SF 的活性作比较。细胞抑制试验表明，与西兰花提取物相比，20 μmol/L的SF 在B16 细胞的抑制率和提高NQO1 酶活方面具有更好的活性。这主要是由于本论文通过环缩合法测定西兰花提取物中总ITCs 含量，如前所述，除了SF 外，西兰花提取物中还含有ERN、BITC 等其他异硫氰酸酯，这些活性物对肿瘤细胞增殖的抑制作用比SF 弱。例如，文献表明SF 和ERN 都可以提高A549 肺癌细胞的多抗药性蛋白的表达，但是SF 的活性比ERN 要高[24]。在抑制铜绿假单胞菌等细菌的群体感应方面，SF活性也比ERN 高[25]。根据已有的文献报道，SF 活性是异硫氰酸酯中最强的[9]。因此，尽管RB 组西兰花提取物ITCs 总量也是20 μmol/L，但是由于含有其它的异硫氰酸酯，因此细胞活性相对较低。

NQO1 是绝大多数真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶，能够解除许多天然和合成化合物的毒性，同时又能活化一些醌类抗肿瘤药物[26]。许多天然活性物，如葡萄籽原花青素、生姜提取物、冬凌草甲素等能提高细胞或机体的NQO1 活性[27-29]。西兰花提取物中的ITCs 也可以显著提高膀胱细胞、HL-60 白血病细胞以及小鼠体内膀胱组织或肠粘膜的NQO1 活性[19，30-31]。本论文的结果也表明，西兰花提取物可显著提高 B16 细胞中 NQO1 活性（P ＜ 0.05），因此经常食用西兰花有利于人体健康。通过先酶解再清炒，其ITCs含量和活性与新鲜西兰花没有显著差异，因此该烹饪方法能有效维持西兰花的功能成分和营养价值。

4 结论

本研究结果表明，与直接清炒相比，先酶解再清炒可有效提高西兰花中异硫氰酸酯含量，且能显著提高 B16 细胞中 NQO1 的活性（P＜0.05）。但是不同清炒方式对抑制B16 细胞增殖活性没有显著性差异（P＞0.05）。西兰花先酶解再清炒，其ITCs 含量和诱导NQO1活性与新鲜西兰花没有显著差异（P＞0.05），与直接清炒的西兰花相比存在显著性的差异（P＜0.05），该烹饪方法能有效维持西兰花的功能成分和营养价值。