贮藏温度对三疣梭子蟹蟹肉风味的影响

陈燕婷 李高尚 宣仕芬 周 果 崔 燕 凌建刚 杨文鸽

(1宁波大学食品与药学学院/浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211；2宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)俗称白蟹、梭子蟹，营养丰富，味道鲜美，是我国重要的海洋捕捞和养殖的经济蟹类，2016 年捕捞和养殖产量分别达到54.21万t和12.53万t[1]。捕获后的梭子蟹极易死亡而腐败变质，严重影响其蟹肉风味和食用品质，因此保鲜梭子蟹显得尤为重要[2]。目前主要通过低温保鲜梭子蟹，低温可分为冷冻、微冻、冰温、冰藏及冷藏等。冷冻是指在-10℃或更低温度下贮藏食物，保存期长，但易导致大量冰晶形成及蟹肉蛋白变性、蟹肉干耗，解冻时汁液流失严重。微冻是将食品保存在其冻结点以下1～2℃；与冷冻相比，微冻能减少冰晶的形成而降低冰晶对食品的损伤及其解冻失水率，但仍有部分水分被冻结而产生冰晶，破坏蟹肉肌纤维结构，造成品质劣化[3-4]。冰温贮藏是在0℃到冻结点之间的低温保鲜技术，在该区域温度下食品不冻结，可以避免因冻结而导致质构劣化[5-6]。冰藏和冷藏则分别在0℃及以上温度贮藏，能耗低，但蟹肉容易腐败变质，保质期短。在上述低温保鲜方法中，冰温贮藏能保证食品无冰晶生成，减少对肌肉细胞的破坏，同时能有效抑制微生物生长和酶的活性，因此冰温贮藏可克服冷冻和冷藏等部分缺陷，提高食品的保鲜性能[7-8]。

有关水产品冰温贮藏技术的应用成为当下研究热点之一。Bahuaud等[9]发现-1.5℃冰温贮藏的大西洋鲑鱼较冷藏大西洋鲑鱼的货架期延长了4周；Gallart-jornet等[10]研究了鲑鱼肉片在冰温、冰藏和冻藏条件下的品质变化，发现冰温贮藏的鲑鱼肉片较冰藏的货架期延长了9 d，且冰温贮藏对鱼肉蛋白降解、变性等均有明显的抑制作用；凌萍华等[11]发现冰温能延缓南美白对虾多酚氧化酶活力的增长，减缓对虾黑变，从而改善食品感官品质，其货架期可达冷藏组的2倍；周果等[12]发现冰温贮藏能延缓梭子蟹品质劣化，贮藏期间蟹肉TVB-N值、菌落总数、感官评分等变化均比冰藏、冷藏组缓慢。鉴于风味对蟹肉品质的重要性，本研究运用电子鼻分析不同贮藏温度下梭子蟹蟹肉的挥发性风味，并结合ATP 关联物、游离氨基酸含量等进行分析，以期为丰富水产品风味化学理论及冰温保鲜技术的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)，10月份购自宁波路林水产市场，每只质量200 ± 20 g，购买后放置于加冰泡沫箱，并于30 min 内运至实验室，随后通过解剖针插入口腔机械致死。

腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)、腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)、腺苷酸(adenosine monophosphate，AMP)、肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)、次黄嘌呤核苷(hypoxanthine riboside，HxR)、次黄嘌呤(hypoxanthine，Hx)标准品、氨基酸标准品购自上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要仪器与设备

PEN3便携式电子鼻系统，德国Airsense 公司；Waters ACQUITY UPLC Ⅰ-Class 超高压液相色谱仪，上海沃特世科技有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；L93-1电子温度记录仪，杭州路格科技有限公司；Biofuge Stratos型高速冷冻离心机，德国Thermo Scientific SORVALL公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 梭子蟹的冰点参考文献[12]。将梭子蟹随机分为3组[冰温(freezing-point storage，FS)组、冷藏(cold storage，CS)组和冰藏(ice storage，IS)组]，每组30只，分别贮藏于冰温库(-1.5 ± 0.1℃)、冷藏库(4.0 ± 0.1℃)及冰藏箱(0 ± 0.3℃，加冰泡沫箱置于室温环境，每24 h更换冰块)，在贮藏第0、第2、第4、第6、第8天取蟹体肉样品进行指标测定，贮藏当天即为第0天。

1.3.2 蟹肉挥发性风味的分析 取1 g 蟹肉样品于15 mL 顶空瓶中，密封后在35℃水浴锅中平衡20 min，采用电子鼻进行检测。参数：载气流量300 mL·min-1，传感器清洗时间60 s，气体进样流量300 μL·min-1，数据采集时间40 s。

1.3.3 蟹肉ATP联物含量的测定 参考SC/T 3048-2014[13]的方法进行测定。

1.3.4 蟹肉游离氨基酸含量的测定 参照张进杰[14]的方法并略作改动。称取2.5 g样品，加10 mL蒸馏水匀浆后沸水浴5 min，10 000 r·min-1离心10 min，重复浸提2次，合并2次的上清液，然后将上清液定容到50 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后保存备用。

色谱条件：色谱柱Zorbax Eclipse-AAA PN 963400-902(4.6 mm×150 mm)，粒径3.5 μm。柱温40℃；流速1.5 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长254 nm。流动相A：40 mmol·L-1NaHPO4，流动相B：乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10,v/v/v)。

1.3.5 蟹肉呈味物质滋味强度值的计算 滋味强度值(taste active value，TAV)按照公式(1)计算[15]：

TAV=样品中呈味物质浓度 /呈味物质阈值

(1)。

1.3.6 蟹肉味精当量的计算 呈味核苷酸(包括5′-IMP和5′-AMP)与谷氨酸等鲜味氨基酸产生协同增鲜作用，采用味精当量(equivalent umami concentration，EUC)法分析鲜味氨基酸与核苷酸的的鲜味协同效应[16]。EUC按照公式(2)计算：

EUC (g MSG·100g-1)=Σaibi+1 218×(Σaibi)×(Σajbj)

(2)

式中，ai、aj 分别为鲜味氨基酸和呈味核苷酸浓度(g·100g-1)；bi为鲜味氨基酸相对于味精的相对鲜度系数(Asp为0.077，Glu为1.0)；bj为呈味核苷酸相对于IMP 的相对鲜度系数(5′-IMP 为1，5′-AMP 为0.18)；1 218为协同作用常数；MSG为谷氨酸钠(monosodium glutamate)。

1.4 数据处理

所有试验均重复3～5次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度对蟹肉挥发性风味的影响

由图1可知，FS组蟹肉的2个主成分总贡献率为90.56%，贮藏第0、第2、第4、第6天时蟹肉的主成分分析(principal component analysis，PCA)图出现重叠，电子鼻无法明确区分贮藏前6 d蟹肉的嗅感，说明冰温贮藏前6 d 蟹肉的风味变化不明显；贮藏第8天时，FS组蟹肉的风味发生明显变化。IS组和CS组蟹肉的两主成分总贡献率分别为95.46%和95.71%，贮藏第0天与第2天、第4天与第6天IS组蟹肉的PCA 图部分重叠，而贮藏第2天与第4天、第6天与第8天CS组蟹肉的PCA图部分重叠，说明随着贮藏时间的延长，IS组和CS组蟹肉的风味变化均较为明显。可见，贮藏温度对蟹肉的主成分分析产生影响，与CS组和IS组蟹肉相比，贮藏前期FS组蟹肉挥发性风味的变化更为缓慢。

图1 不同贮藏温度下蟹肉风味的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of the flavor ofcrab meat at different storage temperatures

由图2可知，贮藏第2天时，IS组和CS组蟹肉风味的PCA 图分开，但均与FS组蟹肉风味的PCA部分重叠；贮藏第4天时FS组、IS组和CS组3组蟹肉风味的PCA 图各自分开，说明电子鼻能完全区分贮藏 4 d后各处理组蟹肉的风味。

图2 相同贮藏时间下蟹肉风味的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of the flavor of crab meat at the same storage time

2.2 贮藏温度对蟹肉ATP 关联物含量的影响

由表1可知，蟹肉ATP初始含量为219.68 mg·100g-1，随着贮藏时间的延长，各处理组蟹肉ATP 含量不断降低，但FS组蟹肉IMP 含量一直高于其他处理组，FS组、IS组、CS组中ATP分别于贮藏第8、第8、第6天未检出。除CS组贮藏第8天时的ADP外，贮藏期间各处理组蟹肉的ADP 含量之间无显著差异。贮藏期间，FS组、IS组中蟹肉AMP 含量在贮藏第2天均明显增加，随后下降，FS组蟹肉的AMP含量均显著高于同期IS组和CS组(P<0.05)。蟹肉HxR、Hx初始含量较少，但随着贮藏期的延长呈不同程度的增加趋势。

IMP和AMP呈味阈值分别为50、25 mg·100 g-1[17]。由表2可知，FS组蟹肉IMP、AMP的滋味强度值(TAV)均高于IS组和CS组，表明冰温贮藏的蟹肉AMP、IMP更丰富，其味道更鲜美。

2.3 贮藏温度对蟹肉游离氨基酸含量的影响

游离氨基酸主要呈鲜、甜、甜苦、苦味等，其中谷氨酸和天冬氨酸呈鲜味，甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)呈甜味，精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、赖氨酸(Lys)和缬氨酸(Val)呈甜苦味，其他为不愉悦的苦味[18]。由表3可知，蟹肉中含量最丰富的游离氨基酸是Arg，其次为Gly。Gly具有甜味，同时当有IMP 存在时，呈甜苦味的Arg甜度显著增加，有助于保持蟹肉良好风味[19]。

由表4可知，随着贮藏时间的延长，蟹肉中游离氨基酸总量和甜味氨基酸占总游离氨基酸的百分比呈下降趋势，而甜苦味氨基酸的比例除FS组和IS组贮藏第2天外，均有所上升；FS组游离氨基酸总量和鲜味氨基酸均高于同期IS组、CS组，说明随着贮藏时间的延长，蟹肉良好的风味受到影响，而冰温贮藏能延缓蟹肉风味劣化。

表1 贮藏温度对蟹肉ATP关联物含量的影响Table 1 Effect of storage temperature on the contents of ATP-related compounds in crab meat /(mg·100g -1)

注：同列不同小写字母表示同一贮藏时间下各处理组该成分含量差异显著(P<0.05)；“-”表示未检测出。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate that the content of this component is significantly different among treatment groups at the same storage time(P<0.05). ‘-’ represents undetected. The same as following.

表2 贮藏温度对蟹肉AMP、IMP滋味强度值(TAV)的影响Table 2 Effect of storage temperature on the taste active values of AMP and IMP in crab meat

由表5可知，贮藏第0、第2天时，各处理组蟹肉中的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、组氨酸对蟹肉整体滋味贡献最为明显；贮藏第4天时蟹肉中呈味氨基酸以谷氨酸、甘氨酸、精氨酸和组氨酸为主；贮藏第6天时蟹肉中呈味氨基酸以谷氨酸、精氨酸和组氨酸为主；贮藏第8天时IS组和CS组蟹肉中呈味氨基酸以精氨酸和组氨酸为主，而FS组仍以谷氨酸、精氨酸和组氨酸为主要呈味氨基酸。随着贮藏时间的延长，各处理组蟹肉中具良好风味的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的TAV 呈下降趋势，而具有不愉悦风味的组氨酸的作用越来越突出，以致蟹肉风味劣化。综上，FS组蟹肉的鲜味、甜味比IS组、CS组保留时间更长。

表3 贮藏温度对蟹肉游离氨基酸含量的影响Table 3 Effects of storage temperature on the contents of free amino acid in crab meat /(mg·100g-1)

表3(续)

注：(+)表示味道愉悦，(-)表示味道不好，ND 表示未查到该氨基酸阈值。

Note: (+) represents pleasure taste. (-) represents bad taste. ND indicates the threshold of amino acid was not consulted.

表4 贮藏温度对蟹肉不同味感游离氨基酸总量的影响Table 4 Effect of storage temperature on the total contents of free amino acids with different odor in crab meat

表5 贮藏温度对蟹肉游离氨基酸的滋味强度值的影响Table 5 Effect of storage temperature on the taste active values of free amino acids in crab meat

2.4 贮藏温度对蟹肉中游离氨基酸与核苷酸协同增鲜效果的影响

由表6可知，即死梭子蟹的味精当量(EUC)为7.40，即每100 g 蟹肉的鲜味强度相当于7.40 g味精所产生的鲜味。FS组蟹肉EUC值均比同期IS组、CS组高，且在贮藏第2天达最大值，这可能是由于梭子蟹AMP 脱氢酶活性较低，使AMP不能被快速分解，导致其累积所致。随着贮藏时间的延长，IS组、CS组蟹肉的EUC值均逐渐减小，CS组在贮藏第8天降至0.83，此时梭子蟹已处于腐败状态。

表6 贮藏温度对蟹肉味精当量的影响Table 6 Effect of storage temperature on the equivalent umami concentration of crab meat /(g MSG·100g -1)

3 讨论

本研究中电子鼻分析结果显示，冰温贮藏(FS组)第0、第2、第4和第6 天蟹肉风味的PCA图重叠，直到贮藏第8天完全分离；CS组、IS组分别在贮藏第2、第4天与第0天蟹肉的PCA图完全分离，这与周果等[12]的研究结果一致。本试验中，贮藏第2天，FS组与IS组、CS组蟹肉风味的PCA图均有交叉，直到贮藏第4 天时电子鼻才能明显区分各处理组蟹肉嗅感。不同贮藏温度下蟹肉成分的变化速率不同，贮藏前期梭子蟹挥发性风味变化缓慢，嗅感差异小；后期由于贮藏温度不同，蟹肉变质程度不同而产生不同的挥发性成分。

即死蟹中ATP 含量十分丰富，随后ATP 首先被降解为ADP，并进一步降解为HxR 和Hx[20-21]。本研究结果表明，CS组蟹肉中ATP于贮藏第6天不可检出，FS组和IS组于贮藏第8天不可检出，说明贮藏温度越高，ATP降解速度越快。AMP 有压抑苦味的特性，赋于食物理想的甜味和鲜味[20]；IMP 的呈味特性与AMP 相似，能增强食品的鲜味和甜味；Hx是ATP降解的最终产物，和半胱氨酸等含硫氨基酸作用会产生含硫的杂环挥发性物质，呈苦味，对食品的风味有不良影响，贮藏后期Hx含量的上升导致蟹肉风味劣化[22]。本试验中，FS组和IS组蟹肉贮藏第2天时的AMP含量高于初始值，这是因为甲壳纲动物AMP脱氨酶的活性较低[23]，贮藏前期尤其是低温下AMP 更容易产生累积。此外，与IS组、CS组相比，FS组蟹肉中冰温条件下AMP累积、IMP下降和Hx上升速度均比较缓慢，这有利于保持蟹肉的美味。

滋味强度值(TAV)是指呈味物质浓度与其阈值之间的比值，可评价样品中某一组分对鲜味强度的影响。当某一物质的TAV 大于1，说明该物质对食品的滋味有贡献，TAV 越大贡献越大。AMP的呈味特性与其浓度有关，高浓度具有显著的甜味和鲜味，低浓度时只有甜味；AMP 和IMP 之间也有协同作用，当存在浓度较低的IMP 时，AMP的鲜味和甜味增强。此外，在食品风味的形成过程中，氨基酸不仅提供其自有滋味，还与其他滋味物质相互协同平衡，如L-谷氨酸与 5′-核苷酸之间有非常显著的鲜味相乘作用。味精当量(EUC)反映呈鲜物质之间的鲜味协同效应，更直观的表示游离氨基酸和呈味核苷酸的作用以及它们之间的协同增鲜效应[24～26]。冰温贮藏有利于保持或增加食品鲜味成分，延缓不良味感成分的产生，如薛松等[27]比较了冰温贮藏和普通冷藏对鸡肉鲜度和游离氨基酸变化的影响，发现冰温贮藏能更明显地增加谷氨酸等游离氨基酸含量，提高鸡肉鲜味；Erikson等[28]认为冰温能减少鱼肉中与腐败有关的挥发性含氮物的生成，抑制鱼类的腐败速度，同时增加与鲜味有关的氨基酸浓度。本试验中，FS组蟹肉IMP、AMP及具有良好风味的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的TAV、EUC一直高于IS组和CS组，说明冰温贮藏更能保持蟹肉的美味，这与前期研究结果一致[12]。

4 结论

冰温组梭子蟹在贮藏前6 d 主要挥发性风味变化不明显，而冷藏组和冰藏组分别在贮藏第2、第4天时出现明显变化，贮藏温度越高，蟹肉气味的变化越快。贮藏期间，各处理组IMP含量随贮藏时间延长而降低，冰温组AMP、IMP含量及TAV 均高于同期冰藏组和冷藏组，冰温贮藏能为蟹肉提供更多的美味核苷酸。蟹肉中含量最丰富的游离氨基酸是精氨酸，其次为甘氨酸，主要的呈味氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、组氨酸，但随着贮藏时间的延长，鲜甜味氨基酸对蟹肉风味的贡献越来越小，而呈现苦味的组氨酸的作用越来越突出，导致蟹肉风味劣变；冰温组蟹肉的鲜、甜味比冰藏组和冷藏组保留时间更长，其EUC值均高于同期冰藏组和冷藏组。蟹肉的风味物质种类复杂，除ATP关联物和游离氨基酸外，不同贮藏温度下梭子蟹蟹肉中甜菜碱、呈味肽、有机酸等滋味物质及挥发性嗅感成分的变化尚有待于进一步分析。综上，冰温贮藏能更好地保持蟹肉原有风味，延缓梭子蟹品质的劣变。