以黄连素/羟丙基-β-环糊精为荧光探针检测金刚烷胺

许 岩 贺永桓 郑舒文 刘宇宁 陈卫华

(中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

β-环糊精含有7个葡萄糖单元，各个单元通过 α-1,4 糖苷键相互连接，形成一个圆锥状化合物，具有 “内疏水外亲水”的结构特性[1-2]。而羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)是在β-环糊精的C-2、C-3或者C-6位的羟基上引入羟丙基形成的化合物，该基团的引入导致分子内的氢键被打开，使得β-环糊精内部的规则性结构逐渐分散成多组分的结构混乱的化合物，从而有效提高HP-β-CD的溶解度[3-5]。由于HP-β-CD在水中具有较好的溶解性，因此在食品、医药领域被广泛应用。

金刚烷胺(amantadine，AMD)是一种用于人类流感治疗，抵抗病毒入侵的药物[6]。研究表明，金刚烷胺类药物可用于畜禽流感的预防和早期治疗，且具有良好的治疗效果[7]。但长期过量使用金刚烷胺类药物会使畜禽类产生中毒症状，影响动物肉质品质，通过食物链也会危害人类健康[8]。因此，农业部规定禁止将金刚烷胺类药物用于动物疫病防治，但仍存在着在兽药制剂中非法添加金刚烷胺的现象，给动物源食品安全问题及人类健康造成了极大威胁。目前，金刚烷胺的检测方法主要有液相色谱法、化学发光法、酶联免疫试剂盒、电化学法等[9-11]，上述检测方法灵敏度高、检测性好，但价格昂贵。此外，上述方法在前期处理时需要耗费较长的时间，处理过程繁琐，只适用于小范围内的检测。而荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点，广泛用于药物的测定。但金刚烷胺的水溶液没有荧光，采用常规的荧光分光光度法不能直接测定，故若想采用荧光分光光度法测定金刚烷胺，可基于主客体竞争性包合作用，建立一种快速、简便、灵敏度高的金刚烷胺测定的新方法。盐酸黄连素(berberine hydrochloride，BRH)又称小檗碱，是一种天然的异喹啉生物碱[12]，具有一定的抗微生物活性及抗菌消炎功效[13]。黄连素的水溶液荧光很弱，当有羟丙基-β-环糊精及葫芦[7]脲等大环分子存在时，荧光显著增强，该现象可能是由于黄连素与大环分子之间形成了包合物[14-15]。基于此，本研究试图建立一种以BRH/HP-β-CD为荧光探针来测定金刚烷胺的荧光光谱分析法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

黄连素标准品，上海源叶生物科技有限公司；羟丙基-β-环糊精，美国Sigma公司；金刚烷胺标准品，美国Sigma公司；淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸镁，国药试剂有限公司；所用试剂均为分析纯，试验前未进一步纯化。分别配制1×10-3mol·L-1羟丙基-β-环糊精、黄连素、金刚烷胺贮备液并置于25 mL 棕色容量瓶中保存备用。

FS5型荧光分光光度计，英国爱丁堡公司；FiveEasy型pH计，上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司；NW型纯水系统，立康生物医疗科技控股有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 BRH/HP-β-CD/AMD系统的荧光光谱响应的测定 以350 nm为激发波长，采用荧光分光光度计分别测定5×10-4mol·L-1羟丙基-β-环糊精、黄连素、金刚烷胺、黄连素/羟丙基-β-环糊精、黄连素/羟丙基-β-环糊精/金刚烷胺溶液荧光发射光谱图。

1.2.2 HP-β-CD对BRH溶液荧光增敏作用的测定 移取1 mL 5×10-4mol·L-1黄连素样品溶液于10 mL比色管中，逐渐加入适量的5×10-4mol·L-1的羟丙基-β-环糊精样品溶液，超纯水定容并充分震荡后，室温下超声15 min，待溶液达到平衡后，以350 nm为激发波长测定其荧光发射光谱。

1.2.3 HP-β-CD与BRH溶液包合比的测定 配制一系列不同浓度的羟丙基-β-环糊精和黄连素的混合溶液，维持总浓度为 1×10-4mol·L-1，改变HP-β-CD在总溶液中的摩尔比率(0～1)，以350 nm为激发波长进行荧光光谱的扫描，记录其在540 nm处的荧光强度最大值，并计算出荧光猝灭值(△F)[16]。

1.2.4 金刚烷胺对BRH/HP-β-CD包合物的荧光猝灭作用的测定 将5×10-4mol·L-1羟丙基-β-环糊精、黄连素样品溶液等体积混合，在室温下超声15 min，向比色管中加入适量的金刚烷胺样品溶液，超纯水定容至100 mL，超声(25 kHz)15 min，待溶液达到平衡后，将其置于1 cm 比色皿中，以350 nm为激发波长进行荧光光谱的扫描。

1.2.5 pH值对荧光强度影响的测定 分别移取1×10-2mL BRH/HP-β-CD和BRH/HP-β-CD/AMD混合溶液加入到装有不同pH值(2～12)BR缓冲液的10 mL比色管中，超声震荡混匀，测定其在540 nm处的荧光强度最大值。

1.2.6 共存物干扰的测定 在BRH/HP-β-CD/AMD系统中，分别加入浓度为金刚烷胺浓度3 000倍的淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸镁6种常见赋形剂[17]溶液，并测定混合溶液在540 nm处的荧光强度最大值。

1.2.7 药物分析 首先将10粒盐酸金刚烷胺药片研磨成粉末，称量相当于10 mg药物粉末，超声溶解后定容至100 mL。取10 mL溶液进一步稀释10倍得到10 mg·L-1的盐酸金刚烷胺溶液。随后按照试验需求稀释至所需样品溶液，进行荧光强度的测定，并根据线性方程计算金刚烷胺浓度。

2 结果与分析

2.1 BRH/HP-β-CD/AMD系统的荧光光谱响应

羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为β-环糊精的类似物，具有与β-环糊精相类似的“内疏水外亲水”的结构特性，使得其能够作为主体分子与许多客体荧光分子形成包合物。为进一步研究主客体竞争性包合作用的光谱变化，本研究测定了BRH/HP-β-CD/AMD系统的荧光发射光谱图(图1)。结果表明，HP-β-CD和金刚烷胺(AMD)几乎没有荧光信号，黄连素(BRH)具有较弱的荧光，而BRH/HP-β-CD的荧光强度最强，当向两者的混合溶液中加入AMD溶液时，荧光强度又逐渐减弱。故依据此现象，建立一种金刚烷胺检测的新方法。

图1 不同混合溶液的荧光发射光谱图Fig.1 Fluorescence emission spectra of different mixed solutions

2.2 HP-β-CD对BRH溶液荧光增敏作用

由图2可知，酸性条件下，向BRH水溶液中加入不同浓度的HP-β-CD时，荧光强度逐渐增强(Ⅰp/Ⅰp0=6.42, λmax(em)=550 nm)且发生轻微红移，这是由于HP-β-CD与BRH水溶液之间形成包合物，BRH进入到HP-β-CD的空腔中，而HP-β-CD的空腔是疏水，进而使BRH处于一个相对稳定的微环境，避免了水溶液对其荧光造成的猝灭，从而使荧光强度逐渐增加。

注：箭头所指方向表示HP-β-CD浓度逐渐增加。Note：The direction of the arrow indicates the concentration of HP-β-CD increased gradually.图2 HP-β-CD浓度对BRH溶液荧光强度的影响Fig.2 Effect of HP-β-CD concentration on fluorescence intensity of BRH solution

2.3 HP-β-CD与BRH溶液包合比的测定

为了更好的确定HP-β-CD与BRH水溶液的结合比率，采用Job’s曲线计算包合比。以HP-β-CD的摩尔分数为横坐标，以荧光强度的变化值(△F)为纵坐标绘制Job’s曲线图(图3)。随着HP-β-CD摩尔分数的增大，△F呈现先增大后减小的趋势，当HP-β-CD摩尔分数为0.5时，其相对荧光强度最大，可见HP-β-CD与BRH的最佳包合比为1∶1。

2.4 AMD对BRH/HP-β-CD包合物的荧光猝灭作用

将HP-β-CD与BRH溶液以最佳包合比1∶1进行混合，测定AMD浓度对BRH/HP-β-CD包合物荧光强度的影响(图4)。随着AMD浓度的增加，包合物的荧光强度逐渐减弱，AMD进入HP-β-CD内部，与空腔中的BRH竞争疏水环境，最终将包合物中的BRH置换出来，形成新的AMD/HP-β-CD包合物，AMD本身没有荧光，被置换出来的BRH溶液与环境中的水接触，荧光被猝灭，进而引起整个系统的荧光猝灭效应。

图3 BRH/HP-β-CD包合物的Job’s曲线图Fig.3 The job’s plot of BRH/HP-β-CD complex

注：箭头所指方向表示AMD溶液浓度逐渐降低。Note：The direction of the arrow indicated the concentration of AMD decreased gradually.图4 AMD溶液浓度对BRH/HP-β-CD混合溶液荧光强度的影响Fig.4 Effect of AMD concentration on fluorescence intensity of BRH/HP-β-CD mixture solution

2.5 AMD工作曲线、线性范围和检测限

在最佳试验条件下，测定结果显示AMD(C)浓度与荧光猝灭值△F之间呈良好的线性关系，在0.05～4.5 mg·L-1范围内，线性方程为△F=460+2 421.33C，相关系数为0.989 3， 表明两者线性关系良好，检测限(S/N=3)为0.03 mg·L-1，表明该结果能够用于AMD的检测。

2.6 pH值对BRH/HP-β-CD、BRH/HP-β-CD/AMD荧光强度的影响

在二元包合体系和三元包合体系中，pH值可能会影响包合物的包合常数和包合速率，进而引起荧光强度的变化，并对最终的试验结果造成影响。此外，通常情况下的药物制剂中可能会含有酸性或碱性物质。为了评估pH值对荧光强度的影响，本试验测定了pH值为2～12范围内BRH/HP-β-CD，BRH/HP-β-CD/AMD混合物的荧光强度。结果表明，BRH/HP-β-CD的荧光强度整体高于BRH/HP-β-CD/AMD的荧光强度，但两种情况(添加AMD/不添加AMD)在不同pH值溶液中的荧光强度变化不明显(图5)。因此，在测定过程中可以忽略pH值对测量结果造成的干扰。

图5 pH值对BRH/HP-β-CD、BRH/HP-β-CD/AMD荧光强度的影响Fig.5 Effect of pH value on the fluorescence intensity of the BRH/HP-β-CD and BRH/HP-β-CD/AMD

2.7 药物赋形剂对BRH/HP-β-CD/AMD包合物荧光强度的影响

为了确定常见药物赋形剂是否会对金刚烷胺的测定造成干扰，本试验测定了6种常见的药物赋形剂

(乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸镁)对BRH/HP-β-CD/AMD混合溶液在540 nm处的荧光强度最大值的影响。结果表明，各组混合溶液的荧光强度变化值均小于±5%(图6)，说明药物制剂中的常见的赋形剂对金刚烷胺的测定没有干扰，该方法对AMD类药物制剂的测定具有较好的选择性。

图6 药物赋形剂对BRH/HP-β-CD/AMD包合物荧光强度的影响Fig.6 Effect of pharmaceutical excipients on the fluorescence intensity of the HP-β-CD/BRH/AMD

2.8 验证试验

为了进一步验证该方法的可行性，测定了3种不同品牌AMD药片的加标回收率。由表1可知，AMD回收率在92%～101%范围内，说明该方法是有效的，其相对标准偏差均小于1%，表明该方法具有较好的灵敏度。

表1 AMD的加标回收率分析Table 1 The analysis of AMD recovery rate

注：a, b, c 分别表示不同品牌的盐酸金刚烷胺片。

Note: a, b and c indicate different brands of amantadine hydrochloride particles, respectively.

3 讨论

以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的荧光包合客体为荧光探针能够快速、灵敏的测定药物分子[18]。HP-β-CD与客体分子形成包合物后能够显著提高客体分子的荧光强度，这与陈世界等[19]、张全彩等[20]的研究结果一致，羟丙基-β-环糊精分别与中性红、华法林相互作用形成包合物，二者的荧光强度显著增强。最佳包合比的确定有两种方法，一种是Job’s 曲线法[21]，一种是相溶解度法[22]。相溶解度法主要研究包合物的增溶作用，李卫华等[23]采用相溶解度法研究了β-环糊精和HP-β-CD对美沙拉嗪的增溶作用；邓媛等[24]同样采用相溶解度法研究了环糊精对纳他霉素包合过程中的增溶作用。Job’s曲线法主要研究包合比和结合比率等，本研究采用Job’s曲线法测得HP-β-CD与BRH的包合比为1∶1，这与张锴等[25]采用相溶解度法测得的结果一致。

本研究基于HP-β-CD主客体竞争性包合作用检测AMD，在其浓度0.05～4.5 mg·L-1范围内呈线性关系，检测限为0.03 mg·L-1。同样，Wang等[26]采用葫芦脲[7]与黄连素包合物作为荧光探针检测AMD，线性范围为0.004～1.0 mg·L-1，检测限为0.001 2 mg·L-1；汤晓艳等[27]采用液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中的AMD残留，线性范围为0.001～0.1 mg·L-1，检测限为0.002 mg·kg-1；蔡自由等[28]采用微流控芯片测定金刚烷胺片中的盐酸金刚烷胺，线性范围为10～120 mg·L-1, 检出限为0.6 mg·L-1。综上，本试验建立的AMD荧光光谱测定方法具有较好的灵敏度，但其线性范围和检测限还有待进一步提高。

4 结论

本研究设计了一种基于羟丙基-β-环糊精主客体竞争性包合作用的金刚烷胺药物荧光色谱检测方法。该方法通过建立BRH/HP-β-CD包合物的荧光猝灭值与金刚烷胺浓度之间的线性关系实现了对金刚烷胺的检测，检测限为0.03 mg·L-1，并发现溶液pH值和药片中常见的赋形剂对金刚烷胺药物测定结果无影响，其回收率在92%～101%之间，相对标准偏差小于1%，具有较好的灵敏度和选择性，但由于环境温度等条件对包合程度的影响，其灵敏度还有待进一步改善。