AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

张力文，赵俊清，郑玉玲，律清宇，姜永强,

1.安徽医科大学，安徽 合肥 230032；2.军事科学院 军事医学研究院 微生物流行病研究所，北京 100071

金黄色葡萄球菌是造成人类食物中毒的常见致病菌[1-2]。近年来，我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全国已占据第4位。金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌食物中毒的主要因子，是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，共有A～E、G～R17个血清型[3]。

金黄色葡萄球菌肠毒素E（Staphylococcus aureusenterotoxin E，SEE）是金黄色葡萄球菌产生的一种超抗原[4]。作为一种新型的肠毒素，对它的研究还相对较少。SEE具有较好的热稳定性和较低的免疫原性，存在进一步研究的价值[5]。因此，对SEE进行快速准确的检测是非常重要的。

AlphaLISA（amplified luminescentproximity homogeneous assay linked immunosorbent assay）是一种基于2个微球的技术[6]。当2个微球彼此接近时，用波长680 nm的光激发供体微球产生能量，将周围反应体系中的氧分子转变为激发态，并将能量传递给受体微球，最终产生520～620 nm的荧光。该技术操作便捷，用时少，均相免洗，能够快速准确地对抗原进行高灵敏度的检测。

本实验通过AlphaLISA技术构建了SEE的检测方法，对该方法的重复性、特异性和灵敏度进行了验证，并对食品模拟样本和金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

10种金黄色葡萄球菌菌株（326E、1169、2-1、3-3、3-4、AT、A8、SC1、SC2和SC3）、SEE抗原、羊抗肠毒多克隆抗体和SEE小鼠单克隆抗体均为本实验室保存；食品购自市场上的主要品牌商；AlphaLISA检测使用的链霉亲和素偶联供体微球和受体微球为PE公司合成；EZ-Link Sulfo-NHSLC-Biotin试剂盒为Thermo Science公司生产。

1.2 SEE小鼠单克隆抗体的生物素化

从冰箱中取出Sulfo-NHS-LC-Biotin，平衡至室温，取2.2 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin溶于400 μL超纯水中。在1 mg抗体溶液中加入30 μL配制好的生物素溶液，室温孵育60 min，脱盐柱纯化，去除未结合的生物素，生物素标记抗体存放于4℃备用。

1.3 受体微球同抗体的偶联

将 25 μL AlphaLISA受体微球和 75 μL PBS（pH7.4）加到1.5 mL的EP管中，16 000 r/min离心15 min，弃上清，用100 μL PBS（pH7.4）洗涤2次。吸取1.6 μL 5 mol/L的氰基硼氢化钠溶液，加到18.4 μL去离子水中，振荡混匀备用。吸取66.6 μL 50 mmol/L的HEPES缓冲液（pH7.4），加到洗涤好的微球中，超声波混匀；随后与33.4 μL 1.5 mg/mL的抗体、1.25 μL 10%的吐温-20、10 μL配制好的氰基硼氢化钠溶液混合（反应总体系为111.25 μL），37℃孵育 24 h后，在反应液中加入10 μL 65 mg/mL的羧甲氧基胺溶液（用800 mmol/L氢氧化钠稀释），37℃旋转摇床中封闭1 h，16 000 r/min离心 15 min。移除上清，用100 μL 100 mmol/L 的 Tris-HCl（pH8.0）洗 涤 2次，用含0.05%Proclin-300的PBS（pH7.4）重悬并超声，体积为100 μL，存于4℃备用。

1.4 金黄色葡萄球菌的培养

10种金黄色葡萄球菌菌株各取50 μL，分别加到5 mL肉汤培养基中，于恒温培养箱中37℃振荡培养12 h，12 000 r/min离心10 min，菌液上清经20 μm滤膜过滤并存放于4℃备用。

1.5 模拟样本的制备

选取牛奶、夹心面包、火腿肠制备SEE的模拟样本，实验前用R-Bio RIDASCREEN商业化试剂盒对食品原样中是否含SEE进行了检测，确认原样中无SEE存在后，进行模拟样本的制备。

液态奶选取市场上三大品牌全脂牛奶。加入SEE之前，在无菌条件下，用PBS缓冲液按1∶1对牛奶进行稀释。用原奶和PBS稀释的牛奶作为SEE的稀释液，获得含有不同浓度SEE的牛奶模拟样本。

夹心面包选用某知名品牌，配料包括面粉、蛋、奶等多种物质。称取0.4 g面包加到1 mL PBS中，用匀浆仪匀浆，加入PBS缓冲液，制成10%和20%的溶液，用这2种稀释液对SEE进行稀释，获得含有不同浓度SEE的面包模拟样本。

火腿肠选取了某著名品牌。在无菌条件下称取0.4 g火腿肠加到1 mL PBS中，用匀浆仪匀浆，加入PBS缓冲液，制成10%和20%溶液，用这2种稀释液对SEE进行稀释，获得含有不同浓度SEE的火腿肠模拟样本。

1.6 AlphaLISA实验步骤

将5 mg/mL的受体微球和1 mg/mL的生物素标记抗体按照一定比例稀释并混合，体积为20 μL，加入 5 μL不同浓度的 SEE 抗原，37℃孵育15 min，加入25 μL按一定比例稀释的链霉亲和素偶联供体微球（原浓度为5 mg/mL），37℃孵育10 min，用SPECTRAMAX i3（MD）读取信号。

2 结果

2.1 反应体系的优化

AlphaLISA方法需要偶联了羊抗肠毒的受体微球、生物素化的SEE小鼠单克隆抗体和亲和素化的供体微球共3种组分。每种组分不同的使用比，可以对信号值造成较大的差异，所以首先摸索微球各组分使用的稀释比例。

通过比较不同比例下信号值和背景值的比，即信噪比，结果见图1，供体微球的稀释比为1∶125、生物素化的SEE小鼠单克隆抗体的稀释比为1∶2000、受体微球的稀释比为 1∶100时，信噪比最大，为AlphaLISA反应体系的最适条件。

图1 各组分稀释比例的优化

2.2 重复性实验

对AlphaLISA方法重复性的验证，选取了100和0 ng/mL浓度的SEE检测信号。将同一次制备的抗体偶联受体微球的12个重复的信号值作为批内差，分3次制备的抗体偶联受体微球的4个重复的信号值作为批间差。结果显示，AlphaLISA检测SEE的批内差和批间差均小于10%（表1）。这意味着该方法具有良好的重复性，其重要原因在于AlphaLISA是一种均相免洗、操作步骤相对较少的方法。

表1 AlphaLISA检测SEE的批间差和批内差

2.3 灵敏度实验

对SEE敏感性的检测，将SEE抗原用缓冲液从400 ng/mL以1/4梯度稀释至25 pg/mL，采用非线性回归法建立AlphaLISA标准曲线，检测限为100 pg/mL（图2A），缓冲液中SEE检测的线性范围为100 pg/mL～50 ng/mL（图2B）。

图2 SEE检测的标准曲线（A）和线性范围（B）

2.4 特异性实验

除SEE外，一些其他的金黄色葡萄球菌肠毒素如SEA、SEB、SEC、SED，以及易引起食物中毒的肉毒毒素（botulinum toxin，BTX）也包括在特异性评价中。结果表明，SEE与其他毒素均无交叉反应（图3）。说明本实验建立的AlphaLISA方法能够灵敏、特异地检测缓冲液中的SEE。

图3 SEE检测的特异性

2.5 模拟样本实验

SEE也是能够导致食物中毒的一种毒素。本实验选择了牛奶、火腿肠和面包制备食品模拟样本。由于还不清楚食品中过多的杂质是否会对检测产生影响，因此对火腿肠、牛奶和面包进行了适量稀释。采用了3个品牌的全脂牛奶（牛奶1、牛奶2、牛奶3），并用PBS按1∶1的比例进行了稀释。结果表明，无论稀释与否，AlphaLISA均能检测出100 pg/mL的SEE（图4）。除此之外，我们发现牛奶3对SEE检测的信号值有一定的封闭作用，因此SEE检测牛奶样本的预处理应采用PBS进行1∶1的稀释。

火腿肠和夹心面包样本也可检出100 pg/mL的SEE（图5）。制备模拟样本时，40%的火腿肠和夹心面包样本黏性较大，很难混合；稀释到20%后可以用于检测，但重复性不好，且在SEE高浓度时信号值会被压低；当溶液浓度低于20%时，批内CV＜10%，信号值也较好。因此，为了获得重复准确的检测结果，用AlphaLISA方法检测火腿肠和夹心面包等食品样本时，须将其稀释到10%再进行实验。

图4 不同品牌牛奶中SEE的检测

2.6 AlphaLISA对菌液上清液中SEE的检测

选择10株金黄色葡萄球菌分离株，对培养上清液中SEE的检测进行评价。根据文献[7]，除产SEE菌株326E外，其余菌株均为产SEE阴性菌株。结果见图6，AlphaLISA能够成功地将326E与其他9个分离株进行鉴别。

3 讨论

AlphaLISA技术一经出现，就在生物学领域有了较为广泛的应用[8-9]。对于SEE的检测，相比于传统的ELISA方法[10]，AlphaLISA操作更为便捷，均相免洗，用时短。ELISA检测所需样本体积至少为50 μL，而AlphaLISA则只需要5 μL即可。

图5 火腿肠和夹心面包模拟样本中SEE的检测

图6 不同菌株菌液上清的检测

缓冲液中SEE检测的线性范围为100 pg/mL～50 ng/mL，检测限为100 pg/mL，具有较高的灵敏度；与其他几种毒素无交叉反应，具有良好的特异性。在食品模拟样本检测中，由于无法确定食品中复杂成分对检测结果的影响，对不同的食品模拟样本进行了稀释处理。结果显示，该方法对食品样本的耐受性较高，对于不同的食品模拟样本，检测限均可达100 pg/mL。同时，在缓冲液和模拟样品中的变异系数均小于10%，表现出了较好的重复性。除此之外，AlphaLISA方法也可以在金黄色葡萄球菌菌液上清中准确地检测出SEE。综上结果表明，我们所建立的AlphaLISA检测方法不仅适用于食品样本中SEE的检测，同时，在SEE含量较低的金黄色葡萄球菌污染的食物样本中，也可以通过分离培养金黄色葡萄球菌，对菌液上清中的SEE进行检测。