miR-143-3p通过靶向TAK1抑制肺癌增殖和侵袭

廉亮亮，齐书山，袁洪志

北京市房山区良乡医院 胸心血管外科，北京 102400

2018年全球癌症统计报告表明，肺癌发病率和死亡率均居首位[1]。肿瘤异质性和预后不良是导致肺癌患者高死亡率的主要原因，近几年虽然肺癌的诊断治疗取得了实质性进展，但肺癌的整体5年生存率仍不超过18%[2]。因此，探究肺癌发生发展的分子机制，为肺癌提供更新的治疗策略是十分必要的。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类包含19～25个核苷酸的单链非编码RNA，可以通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）相互作用调节基因表达[3]。据报道，miRNA可以在包括肺癌在内的不同疾病中，作为致癌基因或肿瘤抑制因子[4]，如miR-17-92[5]、miR-21[6]、miR-548a-5p[7]、miR-425-5p[8]促进肺肿瘤发生，而 miR-19a-3p[9]、miR-33a-5p[10]、miR-466[11]和 miR-577[12]充当肿瘤抑制因子。

研究显示，miR-143-3p通过靶向调控基因表达影响癌症的发生发展，如在膀胱癌和结直肠癌中，miR-143-3p通过靶向细胞外信号调节激酶5/蛋白激酶 B（ERK5/Akt）[13]或者通过抑制 KRAS 翻译[14]来抑制肿瘤发展；miR-143-3p通过靶向调控整合素α6（integrin alpha 6，ITGA6）和锚蛋白重复及PH结构域3（ankyrin repeat and PH domain 3，ASAP3）表达抑制结直肠癌转移[15]。我们检测了miR-143-3p在肺癌细胞中的表达情况以及对肺癌细胞功能的影响，并探究了miR-143-3p对转化生长因子β激活激酶1（transforming growth factor beta-activated kinase 1，TAK1）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2018-03-14～2019-03-14在北京市房山区良乡医院普外科手术治疗的10例肺癌患者，每例分别取肺癌组织和癌旁组织；人肺癌细胞系HCC27、H1975、A549，人正常肺上皮细胞 BEAS-2B购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；miR-143-3p mimics和miR-143-3p抑制剂anti-miR-143-3p购自百奥迈科生物技术有限公司；转染试剂LipofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒和SYBR Green染料购自TaKaRa公司；All-in-one miRNA qRT-PCR检测试剂盒和miR-143-3p、U6的引物购自GeneCopoeia公司；凝胶成像仪和化学显色液购自Bio-Rad公司；TAK1抗体、GAPDH抗体和HRP标记的二抗购自Abcam公司。

1.2 miR-143-3p肿瘤组织表达分析

利用starBase在线分析平台挖掘来自癌症基因组图谱（TCGA）的肺癌miR-143-3p表达谱。

1.3 总RNA提取和实时荧光定量PCR

TRIzol法提取细胞总RNA。用All-in-one miRNA qRT-PCR检测试剂盒检测miR-143-3p的表达，以U6为内参。用2 μg总RNA进行反转录，qPCR检测目的基因的相对含量，并以GAPDH为内参，通过 CT（2-ΔΔCt）方法将基因表达标准化。各基因qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 细胞培养和转染

细胞在37℃、5%CO2条件下用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。用LipofectAMINE 2000转染试剂转染细胞，取miR-143-3p mimics和anti-miR-143-3p各50 nmol/L转染细胞，分为阴性对照组（NC）、转染组（miR-143-3p mimics）、转染组（miR-143-3p mimics+anti-miR-143-3p）。

1.5 CCK-8实验

CCK-8法检测3个处理组肺癌细胞的活力。取对数生长期细胞制备单细胞悬液，每孔接种2×103细胞，在培养 1、2、3 d后，每孔分别加入 10 μL CCK-8，温育4 h后测定每孔的D450nm值，以时间为横坐标、D450nm值为纵坐标绘制曲线。

1.6 细胞迁移实验

将Transwell小室放入24孔板中，并在孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的培养基作为下液，继续培养24 h后取出小室。用甲醇固定15 min，DPAI染色10 min，PBS清洗后在荧光显微镜下观察，拍照，计数。

1.7 细胞侵袭实验

取出冻存的Matrigel基质胶，4℃过夜融化，取适量预冷的无血清培养基按1∶5稀释Matrigel胶，混匀后加入Transwell小室中。其余步骤同Transwell迁移实验。

1.8 蛋白质印迹法检测TAK1蛋白表达水平

取适量RIPA蛋白裂解液在冰上裂解收集的细胞，离心收集上清，测定蛋白质浓度，制备蛋白上样液，用10%SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束后，恒流电转至PDVF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭后，将膜与TAK1抗体、GAPDH抗体一起孵育。以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，化学显色液显色后，放至凝胶图像分析仪中成像。

1.9 统计分析

数据用GraphPad Prism 7进行统计学分析。计量数据以x±s表示，组间数据采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD检验方法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-143-3p在肺癌组织中的表达

通过starBase对TCGA数据库中有关miR-143-3p在肺癌中的表达数据进行分析，数据中包括512例肺腺癌和475例肺鳞癌，相应癌旁正常组织作为对照样本。结果显示，无论在肺腺癌组织中还是在肺鳞癌组织中，miR-143-3p的表达量均明显低于相应对照组织中的表达；此外，还检测了miR-143-3p在10例肺癌患者中的表达，同样发现miR-143-3p在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织中的表达。这说明miR-143-3p可能在肺癌中发挥着重要作用。结果见图1。

图1 miR-143-3p在肺癌组织中的表达特点（**P＜0.01）

2.2 miR-143-3p在肺癌细胞系中的表达

qRT-PCR检测3个肺癌细胞系中miR-143-3p的相对表达量，结果见图2，miR-143-3p在肺癌细胞中的表达量显著低于在正常细胞BEAS-2B中的表达，这与miR-143-3p在肺癌组织中的表达情况一致。

2.3 miR-143-3p对肺癌细胞增殖活力的影响

选取肺癌细胞H1975、A549检测miR-143-3p表达对肺癌细胞增殖活力的影响，结果见图3。NC对照组和miR-143-3p+anti-miR-143-3p组肺癌细胞增殖活力均显著高于miR-143-3p组，说明miR-143-3p抑制肺癌细胞的增殖活力。

图2 qRT-PCR检测miR-143-3p在肺癌细胞系中的表达（*P＜0.05）

图3 CCK-8法测定miR-143-3p表达对肺癌细胞H1975、A549活力的影响（*P＜0.05）

2.4 miR-143-3p对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

采用Transwell法进一步探究miR-143-3p过表达对肺癌细胞的迁移和侵袭的影响，结果见图4。在2种肺癌细胞系中，miR-143-3p组的迁移和侵袭相对活力显著低于NC对照组和miR-143-3p+anti-miR-143-3p组，而NC对照组和miR-143-3p+anti-miR-143-3p组间没有显著差异，说明miR-143-3p过表达抑制肺癌细胞的侵袭和迁移。

2.5 miR-143-3p在肺癌细胞中对ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表达的影响

已有研究显示，miR-143-3p可以靶向调控ITGA6、ASAP3抑制结直肠癌的转移[15]，也可以靶向调控黑色素瘤相关抗原A9（melanoma-associated antigen-A9，MAGE-A9）抑制喉部鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭[16]，还可以靶向调控TAK1表达抑制卵巢癌的进展[17]。因此，我们检测了在肺癌细胞系 H1975、A549中 miR-143-3p对 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1表达的影响。从图5可以看出，miR-143-3p能够使 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表达均降低，但其中对TAK1表达的影响最为显著。

2.6 miR-143-3p在肺癌细胞中对TAK1蛋白表达的影响

图5显示，miR-143-3p对TAK1 mRNA表达影响最为显著，因此相应检测了miR-143-3p对TAK1蛋白表达的影响，结果见图6。与对照相比，miR-143-3p过表达显著降低了TAK1蛋白的表达，但miR-143-3p抑制剂处理后，TAK1蛋白表达水平又恢复至对照水平。该结果说明在肺癌细胞中miR-143-3p可以抑制TAK1的表达。

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率均居全球癌症发病和死亡的首位，而我国肺癌发病数和死亡数分别占全球的37%、39.2%[18]。虽然近年在肺癌诊断和治疗方面取得了一些进展，但肺癌的预后仍然不理想。探究肺癌发生发展机制，为肺癌的诊断和治疗提供新的思路和靶标是十分必要的。

本研究表明，肺癌细胞中的miR-143-3p表达水平低于肺正常上皮细胞，同时我们通过starBase分析TCGA数据库中miR-143-3p在肺癌组织中的表达和检测肺癌患者组织样品发现，miR-143-3p在肺癌组织中的表达水平也低于正常肺组织，与细胞中的检测结果一致。这提示miR-143-3p可能在肺癌进展过程中发挥重要作用。为了进一步探究miR-143-3p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，我们通过CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验发现，miR-143-3p过表达抑制了肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，表明miR-143-3p可以作为肿瘤抑制因子，这为肺癌肿瘤治疗提供了新的思路。

为了探讨miR-143-3p抑制肺癌细胞进展的机制，我们通过qRT-PCR检测ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的表达，发现miR-143-3p过表达后，肺癌细胞中 ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1的mRNA表达水平均降低，但其中对TAK1表达的影响最显著。进一步采用蛋白免疫印迹检测，发现miR-143-3p同样也显著抑制TAK1蛋白表达水平。TAK1属于丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族，参与控制各种细胞系统中p38MAPK和JNK的激活[19]。TAK1是内皮细胞凋亡和转移的关键调节因子[20]，TAK1的缺失会导致JNK和NF-κB信号传导失活，后两者都在细胞存活和增殖中起关键作用[21]。因此，miR-143-3p可能通过调控TAK1的表达来影响肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

图4 Transwell法测定miR-143-3p表达对肺癌细胞H1975、A549侵袭/迁移的影响（*P＜0.05）

图5 qRT-PCR检测miR-143-3p在肺癌细胞H1975、A549中对ITGA6、ASAP3、MAGE-A9和TAK1 mRNA表达的影响

图6 Western印迹检测肺癌细胞中miR-143-3p对TAK1蛋白表达水平的影响

综上，miR-143-3p在肿瘤细胞中低表达，可以作为肿瘤抑制因子，通过调控TAK1的表达来影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-143-3p为改善肺癌预后提供了新的思路，但miR-143-3p在肺癌进展中详细的分子作用机制和信号通路仍须进一步探究。