利用长距离PCR扩增国内肠道病毒流行株基因组方法的建立和评价

姜棋予，冯帆，柴燕涛，孙慧伟，貌盼勇,侯俊,伯晓晨

1.军事科学院军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850；2.解放军总医院第五医学中心 a.临床检验医学中心，b.临床研究管理中心，北京 100039

人类肠道病毒（human enterovirus，HEV）属于小RNA病毒科肠道病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约7500 bp。婴幼儿手足口病（handfoot and mouth disease，HFMD）主要由A型肠道病毒引起，包括柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CV-A16）、2-8型、10型、12型、14型以及肠道病毒71型（enterovirus 71，EV-71）。CV-A16和EV-71作为主要致病因子，其死亡率在1～3岁儿童中最高[1-2]。手足口病是20世纪90年代末东亚区域新发的儿童高度传染性疾病，构成严重的公共卫生威胁。

基于流行病学分析数据，亚基因组C4是我国EV-71感染的主要菌株，但国内研究甚少，因而对EV-71 C4亚型的毒力位点和毒力决定因素尚不明确[3]。国内的肠道病毒疫苗研制目前处于世界前列，针对我国3种不同分型的灭活EV-71疫苗Ⅲ期临床试验最近完成，对EV-71相关HFMD的保护率为95%[4-5]，但是目前还没有可用于EV-71的疫苗或特异性抗病毒药物。在公共数据库中检索得到的EV-71完整基因组序列信息只有约500条，而人流感病毒A型则有约4500条完整序列信息[6]。因此，肠道病毒的全基因组测序，以及通用易行且准确高效的扩增方法的探索和建立，将为公共数据库提供更多的全基因组序列信息，也是将来对肠道病毒深入研究的垫脚石。

随着二代测序技术越来越广泛地用于病原学研究，测序模板的成功制备显得尤为重要。在病原学检测中，往往存在着病毒拷贝数较低或基因组不易提取等问题，由此对样本前处理提出了更高的要求。因此，建立一种通用的肠道病毒高保真扩增及二代测序方法尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料

肠道病毒样本由本实验室病毒库保存，收集了2014年以来各地区出现的手足口病患儿咽拭子标本。咽拭子标本经Vero细胞或RD细胞等接种，在产生明显的细胞病变后收集病毒液，反复冻融后离心去除细胞碎片收获病毒，于-80℃冻存备用[7]。本研究所用的肠道病毒HEV-96、HEV-124、HEV-19、HEV-1376、HEV-102为 EV-71 C4亚型，HEV-81为CV-A16。

常规PCR仪（PEQLAB公司）；天能凝胶成像分析系统（天能科技有限公司）；UCD-300非接触式全自动超声破碎仪（Biorupter公司）；Ion PGM二代测序仪（Life公司）；7500实时荧光定量PCR仪（Thermo公司）。

1.2 引物设计

肠道病毒全基因序列收集自美国国立生物技术信息中心病毒库（NCBI virus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/）。检索关键词为“Enterovirus 71”和“Coxsackievirus A16”，地理地区（Geographic region）限定为“China”，根据肠道病毒分型分别收集中国地区曾暴发流行的CV-A16、EV-71，病毒序列信息的上传时间（Collect date）限定为近5年（2014-01-01至今）。共90条序列信息，GenBank号如下：JN864022，EU753407.2，GQ994988.1，HQ611148.1，KC954662，KF501389，EU864507.1，JX678875.1，JQ517316，FJ606449.1，EU703814.1，JN052925.1，JN020147.1，HN053670，GQ994991.1，KJ746494，JX244185，FJ607335.1，GQ279370.1，FJ194965.1，EU753375， GU366191， HQ456308， KY612315，KU936131， KU936126， KY582572， KP289430，KP289425， KU936132， KU936121， KP289412，KU936130，KP289421，KU936120，HQ694982.1，MG773122，FJ360544.1，MG773124，KP289413，KU936123， KU936125， KY315729， KX752783，KU936127， LC375764， KP289419， KU647000，MG214681， KU254598， KU254597， KU936124，KP289420， KP289423， KT345960， KP289422，KP289418， MG875331， KP289432， KP289429，KP289424， KU936122， MG773125， KP289431，KT345959， KU936128， KP289428， KP289427，KU936129， KU254595， KP289417， KU254596，MG773123，KX595292，KM215267，MH010200，MH010202， KX595293， KX595295， KX595291，KX595294， KP289426， KT428644， KT428649，KT428650， KT428648， KT428646， KP289416，KP289415，KP289411。

通过肠道病毒基因组序列比对，所有肠道病毒的5'非翻译区（UTR）532～568 bp存在较为保守的序列，在此区域设计保守引物，从病毒cDNA的3'端扩增肠道病毒基因约6.8 kb长片段，如图1中扩增子2所示。肠道病毒基因组前端不存在高保守区，采用多重简并引物扩增，扩增区域如图1扩增子1所示。

图1 肠道病毒引物扩增示意图

1.3 肠道病毒基因组RNA提取及cDNA合成

用 QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN 公司）提取肠道病毒RNA，在操作RNA时严格注意防止RNA酶的污染，在超净台中进行实验。用SuperScript IV First-Strand Synthesis System试剂盒（Invitrogen公司）逆转录合成cDNA，并在此基础上进行铆钉引物的连接。

1.4 长距离PCR扩增

用LongRange HotStart PCR Kit（KAPA公司）进行长距离PCR扩增，总反应体积为100 μL，包含 5×缓冲液 20 μL、25 mmol/L MgCl28 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各 5 μL、酶 4 μL、模板8 μL、甘油 8 μL、水 40 μL。设置退火温度为58℃，前25次循环延伸9 min，后10次循环延伸10 min，最终延伸10 min。

1.5 特异性检测实验

以2种同型EV-71病毒HEV-96、HEV-102混合感染，或以EV-71病毒HEV-61与CV-A16病毒HEV-81混合感染情况分别模拟临床混合病毒感染的情况。2种肠道病毒分别以1∶1、1∶2、1∶10混合，对该混合病毒进行长距离PCR扩增并进行二代测序验证。

1.6 生物信息学分析

用CLC Genomics Workbench软件（QIAGEN公司）进行测序原始数据的质控、格式转换、拼接以及后续下游分析。序列拼接使用De Novo从头拼接工具，设置错配罚分为2、插入与缺失罚分为3、片段相似度为0.8，得到的序列大片段contig进行BLAST比对。

2 结果

2.1 引物设计

如表1，3'端polyA尾逆转录锚定引物为P3UT；扩增子2的正向引物为P3U-5，反向引物为P3U-T2；扩增子1的正向引物为5U-F-1，反向引物为5U-R。

表1 肠道病毒扩增引物

2.2 肠道病毒全基因组扩增

对4株EV-71型肠道病毒逆转录的cDNA，以cDNA为模板进行长距离PCR扩增，各泳道可见约7000 bp的条带（图2A）。肠道病毒5'UTR序列扩增均得到特异性产物，长度约550 bp（图2B）。以上述PCR产物进行二代测序验证，均得到了约1000倍的覆盖度，contig拼接如图2C所示。

图2 肠道病毒全基因组扩增及验证结果

2.3 特异性检测

已知 HEV-96、HEV-102、HEV-61为 EV-71型，HEV-81为CV-A16型。以不同比例混合同型肠道病毒，长距离PCR扩增和简并引物扩增全基因组序列，二代测序获得的测序reads数如图3A；将EV-71与CV-A16不同型肠道病毒以不同比例混合后扩增并测序，获得的测序reads数如图3B。结果表明，测序获得的reads数比例与混合时比例大致相同。在已知的GQ994991.1和GU196833.1重组肠道病毒中[7]，利用该方法扩增获得全基因组序列，通过序列mapping比对能够正确反映重组肠道病毒情况，图3C显示了重组肠道病毒的参考序列比对情况。

3 讨论

近几年乃至几十年间，肠道病毒一直在我国和亚洲范围内持续流行，造成了严重的经济损失和负担。我国手足口病的暴发流行主要在每年的5月和10月，导致疾病的病原体主要是肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型[8-10]。在近几年的肠道病毒流行株中，EV-71 C4亚型占相当高的比例[11]。在肠道病毒实验室诊断中，我们只能得知是否肠道病毒感染以及病毒含量，无法获得肠道病毒的全基因组序列。但是在流行病学以及分子生物学研究中，肠道病毒基因组序列非常重要，通过全基因组序列的生物信息学分析，可以对特定严重病例进行深入的机制研究，也可以断定暴发流行的程度[12]。利用二代测序的肠道病毒全基因组研究更可以区分肠道病毒不同分型的混合感染，得到更准确的肠道病毒流行株序列信息，为绘制高分辨率的病毒谱提供了便利[13]。

肠道病毒的遗传物质为RNA，这导致了自身核酸的不稳定性，对肠道病毒全基因组的准确扩增造成了诸多困难，主要体现在：在传统的分段设计引物时，肠道病毒可能在引物的设计位点发生突变，导致引入突变或引物失效；混合肠道病毒感染情况时引物设计位点含有核酸多态性，特异性引物可能导致混合病毒序列信息的丢失；针对每一株肠道病毒或一批流行株肠道病毒进行引物设计与合成不仅耗费了人力物力，也对试剂和成本造成浪费。因此，我们设计了一系列通用扩增引物，能够涵盖近年来国内暴发的肠道病毒流行株，获得全基因组序列。

图3 肠道病毒全基因组扩增特异性评价

在肠道病毒暴发流行中，EV-71型和CV-A16型为主要出现的病原体，这2种病原体在每年大流行中共同交替与进化[14-15]，在临床诊断和深入研究中，出现了患者混合肠道病毒感染的情况以及肠道病毒重组感染的情况。我们分别对这2种临床可能出现的情况进行了模拟与验证，结果显示我们建立的方法具有分辨混合病毒感染的能力，且通过二代测序的序列读数数量可大概推算2种混合肠道病毒的比例；重组肠道病毒的全序列扩增也同样能够得到真实反映。

我国每年暴发的肠道病毒流行株可能不尽相同，若每年根据肠道病毒流行株的分型信息设计特异性引物，将消耗很大的人力物力，并造成试剂和经济的浪费。我们通过将建立的肠道病毒全基因组序列扩增方法与二代测序技术相结合，节省了连接载体后测序等一系列步骤，节约了科研时间，也为进一步的生物信息学研究提供了准确、足量的数据。