自由基聚合反应修饰的金纳米粒子用于高灵敏度免疫传感器研究

徐力红,林虹君,李高伟，赵飞，尉驰

中国人民解放军32311部队，北京 102112

对临床生物标志物的灵敏、准确检测是早期疾病诊断面临的一大挑战[1-2]。随着对早期生物标志物超灵敏检测的需求日益增加，研究人员更加关注如何创新检测技术或信号放大方法来提高检测灵敏度。对于临床应用，免疫传感器必须是简单、廉价和超灵敏的，并能用于检测患者样本中微量生物标志物[3-5]。但由于现有传感器操作复杂、成本高昂、耗时较长，因此其应用受到了较大限制。为了克服这些问题，人们越来越重视开发新的分析方法来测定超低浓度的分析物和实际样品[6-9]。

金纳米粒子（gold nanoparticles，GNps）作为经典的纳米载体，具有粒径可控、制备简单、导电性好等优点。此外，GNps在不破坏待测物生物活性的前提下，易与蛋白质结合[10-13]。自由基聚合反应作为一种理想的接枝策略，可以在很多载体表面生成非交联、线性聚合物链，该方法最大的优点是聚合物的厚度具有高可控性[14-19]。

在本研究中，我们将辣根过氧化物酶和抗体按照高比例结合，研发出一种新型的由原子转移自由基聚合物（atom transfer radicalpolymer，ATRP）修饰的GNps免疫传感器，用于检测高敏感的生物标志物。由于毛发状的聚合物链为蛋白质提供了大量的活性固定位点，所以该方法具有极高的灵敏度[20-23]。

1 材料与方法

1.1 材料

促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）样本、辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-Ab2）均购自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）均购自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）为南京市威圣化工贸易有限公司产品；柠檬酸钠为上海创顺化工有限公司产品；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均购自北京化学试剂公司；实验用水为二次蒸馏水。

Milli-Q型纯水仪（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20透射电镜（FEI香港有限公司）；85-2数显型恒温搅拌器（国瑞试验仪器厂）；Sorvsll Legend Micro 17离心机（Thermo公司）。

1.2 GNps和引发剂的制备

本研究中GNps按照经典方法制备。

引发剂制备步骤：将11-巯基-1-十一醇溶解于四氢呋喃中，几分钟后加入吡啶，然后通入氮气，将混合物冰浴30 min，最后加入2-溴-异丁基溴，继续搅拌，4 h后将反应液过滤、干燥，即得到引发剂，储存与4℃待用。GNps的透射电镜图像如图1所示。

图1 GNps的透射电镜图

1.3 ATRP修饰GNps

将GNps放入EP管中，在旋转仪上振摇约12 h，用甲醇洗涤3次，加入葡萄糖和引发剂，搅拌、过夜，即得到GNps-ATRP[24-26]。GNps-ATRP的透射电镜图像如图2所示。

图2 GNps-ATRP的透射电镜图

1.4 GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）的制备

首先，将乙二胺加到GNps溶液中，将混合液置于80℃；其次，将含戊二醛的PBS溶液加到以上溶液中，在GNps表面即得到醛基；第三步，将氰化钠加入Ab2和用PBS溶液制备的HRPs溶液中，在Tris-HCl缓冲液中反应24 h，将反应液放置于PBS溶液中，4℃过夜；最后，用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，即得GNps-ATRP-（Ab2+HRPs）。制作过程示意图见图3。

2 结果与讨论

2.1 新方法评价

以CRH为模型分析物，对新方法的性能进行考察。CRH是参与应激反应的小分子肽激素和神经递质，主要由哺乳动物脑组织下丘脑室旁核神经元合成和分泌。高CRH水平与急性高原反应（acute mountain sickness，AMS）的发生直接相关[27]，血浆中CRH水平的高低对预测AMS的发生具有重要的参考意义。因此，该数值可以指导将要去高空旅行或工作的人员采取必要的预防措施，使危害降到最低。由于血液检测较为复杂，且血液中干扰因素太多，对检测的准确性有较大影响，所以我们采取对唾液中的CRH进行测量。众所周知，唾液样本容易获得，且含有较少的干扰物。但唾液中CRH的含量明显低于血浆中CRH的含量，因此，提高免疫传感器的灵敏度就是检测的关键所在。

首先，将受试者唾液中的CRH按不同比例稀释，分别用传统的免疫传感器和新改良的免疫传感器检测。然后，将制备好的样品和2种不同的复合物Ab2-HRPs和GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）孵育后，测量2种免疫传感器的电流响应。接下来，对影响免疫传感器性能的条件进行优化，并进行选择性和干扰性考察，最后利用新型免疫传感器对人唾液样本进行评价。

图3 免疫传感器原理图

采用传统方法和新建立方法检测相同浓度梯度的CRH样本，分别绘制工作曲线。传统方法的线性范围为1～300 pg/mL，检测限为1 pg/mL（图4）；新方法的检测线性范围为0.5～250 fg/mL，检出限为0.5 fg/mL（图5）。因此，由于引入了ATRP修饰的GNps，使得与Ab2结合的HRP大量增加，从而实现了超高的检测灵敏度。为了考察新方法的可重复性，进行了3次独立性实验，结果表明改进后的方法具有较高的重现性。

图4 Ab2-HRPs用于传统免疫传感器检测反应

图5 GNps-ATRP-（Ab2-HRPs）用于新的免疫传感器检测反应

2.2 结论

通过引入ATRP修饰的GNps进行目标蛋白质检测，研制出一种可重复、超灵敏、稳定的新型免疫传感器。新方法的检测限为0.5 fg/mL，是传统免疫传感器方法的2000倍。新的检测策略有望推广到治疗监测和临床疾病筛查领域。改进后的免疫传感器为纳米材料在免疫传感中的应用开辟了新的途径，在未来的临床试验或药物筛选中具有广阔的应用前景。