昆明小鼠和DBA/2小鼠尾静脉注射L1210细胞的比较研究

郑慧广，李鼎昀，落继先

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

小鼠白血病细胞L1210来自小鼠淋巴细胞白血病，生长速度快，增殖周期短，肿瘤细胞增殖比率高，对化疗药物敏感，已广泛用于药物细胞毒性及活性的筛选，目前构建L1210白血病小鼠模型尚未普遍运用[1]。以小鼠白血病细胞L1210细胞系为基础，采用尾静脉注射构建小鼠白血病模型，可进一步用于筛选有效的抗肿瘤药物。本研究比较了以L1210细胞尾静脉注射昆明小鼠或DBA/2小鼠的方法，明确了2种L1210细胞系小鼠白血病模型的生物学特性，为后期L1210细胞迁移的细胞内信号通路及其体内迁移和浸润的研究，以及抗肿瘤药物的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

4～5周龄雌性昆明小鼠购自山西医科大学动物实验中心，体重 20.3～27.2 g，平均 23.4±22.12 g；4～5周龄雌性DBA/2小鼠购自中国辐射防护研究院，体重 18.7～20.7 g，平均 20.16±0.62 g；小鼠淋巴细胞白血病细胞L1210购自中国科学院上海细胞库（ATCC，CCL-219）；高糖型DMEM（Gibco公司）；普通新生牛血清（生工生物工程股份有限公司）；恒温培养箱（Eppendorf公司）；超净工作台（上海博讯实业有限公司）。

1.2 细胞株培养

培养液为高糖型DMEM，添加10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，在37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞悬浮生长，隔天补液，隔天传代。尾静脉注射的L1210细胞均处于对数生长期。

1.3 小鼠饲养

将新采购的小鼠事先饲养1周以适应环境，观察小鼠状态。小鼠饲养于干净、通风的环境中，普通饲料，室温20～27℃，光线昼夜交替，所有小鼠自由摄食、饮水。

1.4 尾静脉注射

适应性饲养1周后，将昆明小鼠随机分为对照组（A组）和实验组（B组），每组5只，实验组尾静脉注射5×106L1210细胞，对照组尾静脉注射等体积的PBS；将DBA/2小鼠随机分为对照组（C组）和实验组（D组），每组6只，实验组尾静脉注射5×106L1210细胞，对照组尾静脉注射等体积的PBS。

1.5 发病情况统计

各组小鼠尾静脉注射L1210细胞后，隔天测量并记录小鼠体重，统计分析；隔天观察并记录小鼠的活动情况；统计各组小鼠存活时间及其死亡率，统计分析。

1.6 器官测量、称重

昆明小鼠饲养56 d后，以颈椎脱臼法处死，取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏等脏器测量其最大直径并称重，统计分析。DBA/2小鼠饲养14 d后，记录死亡率，统计分析。

1.7 数据处理

记录数据，组内多样本均数的比较均采用单因素方差分析，所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析，P＜0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 存活时间和体重变化

4组小鼠存活时间和体重变化见表1。A、B组小鼠存活时间比较，没有统计学差异；A、B组小鼠体重变化比较，没有统计学差异；C、D组小鼠存活时间比较，有统计学差异（P＜0.05）；C、D组小鼠体重变化比较，没有统计学差异。

表1 昆明小鼠和DBA/2小鼠对照组与实验组存活天数和体重变化（x±s）

2.2 发病特征

昆明小鼠注射L1210细胞后，与对照组相比，小鼠活跃程度显著下降，除此之外并无其他明显的表面特征，且在实验期内未出现死亡现象。DBA/2小鼠注射L1210细胞后，第7 d已出现死亡，濒死的小鼠异常躁动，首先会出现左后肢或右后肢单侧偏瘫，紧接着左右后肢或腰部以下截瘫，行动迟缓，之后腰部趋于弓形，最后死亡。DBA/2小鼠死亡率见图1。

图1 DBA/2小鼠对照组及实验组死亡率

2.3 脏器变化

昆明小鼠实验组脾脏明显肿大（图2），脏器重量显著高于对照组（图3）；实验组肺脏重量明显高于对照组（图3）；心脏和肝脏长度及重量无明显变化。与对照组相比，昆明小鼠尾静脉接种L1210白血病细胞后，心脏、肝脏、脾脏、肺脏等脏器均出现不同程度的色泽变化，其中以脾脏的色泽变化最为明显（图4）。

图2 昆明小鼠尾静脉接种L1210细胞后心脏、脾脏、肺脏、肝脏大小变化

图3 昆明小鼠尾静脉接种L1210细胞后心脏、脾脏、肺脏、肝脏重量变化

图4 昆明小鼠对照组与实验组内脏实图

3 讨论

白血病是血液系统的恶性肿瘤，由造血系统发生恶性病变所致。白血病患者的骨髓或其他造血组织中的大量血细胞发生恶性克隆增殖，而正常的血细胞增殖被明显抑制[2-3]。目前，除了少数白血病患者配型成功或通过骨髓移植治疗以外，大部分患者的治疗仍然依赖于化疗和放疗，但会迅速产生耐药性，预后不容乐观[4-5]。因此，白血病治疗新策略一直是多年来的研究重点。细胞迁移是一种细胞运动行为，是由趋化物刺激诱发或外界迁移信号引发的一种生命活动[6-7]。细胞迁移这种动态行为过程是肿瘤细胞向其他组织或器官发生侵袭和转移的关键步骤。白血病细胞的心肌浸润在临床上十分常见，国内外尸体解剖资料显示，34%～66%的晚期白血病患者存在心脏浸润病理[8-9]。脏器浸润是导致白血病病情恶化和死亡的重要原因之一。研究显示，部分急性淋巴细胞白血病患者伴随肝脏、脾脏肿大，肝内、脾内多发性结节白血病浸润及肝脾功能异常[10-11]。虽然多数白血病患者胸片中未显示病理，但研究结果表明白血病细胞肺部浸润发生率为24%～64%，患者胸部并发症种类较多，如单侧或双侧胸腔积水，但在不同病程时期或治疗阶段并发症类型不尽相同[11-12]。异常的白血病细胞向心脏、脾脏、肺脏、肝脏等组织的迁移是白血病细胞向这类功能器官浸润的重要步骤，与白血病的复发有重要联系。因此，研究并揭示白血病细胞迁移的细胞内信号通路，对靶向治疗白血病具有重要意义。

静脉注射[13-14]、腹腔注射[15-19]、皮下接种[20-21]L1210细胞可制备白血病小鼠模型。少数文献报道可以通过睾丸接种L1210细胞制备小鼠白血病细胞睾丸浸润模型[1]。尾静脉注射操作较皮下注射、腹腔注射过程复杂，操作人员培训时间较长，熟练程度要求较高。但在建立白血病动物模型时，使白血病细胞在血液系统增殖更符合临床病理，所以通过尾静脉注射建立L1210白血病细胞小鼠模型是最接近临床表现的造模方式[22-23]。

本实验研究以L1210白血病细胞系为基础，以昆明小鼠和DBA/2小鼠为宿主，构建了L1210白血病小鼠模型，选取心脏、脾脏、肝脏、肺脏为研究指标。实验结果表明，昆明小鼠尾静脉接种L1210细胞后，与对照组相比，实验期内并未出现死亡现象，体重变化不明显，但与对照组相比，实验组小鼠内脏器官差异显著，有明显的脾脏及肺脏肿大；DBA/2小鼠尾静脉注射L1210细胞后，与对照组相比，第7 d出现小鼠死亡现象，且濒死小鼠外观形态特征明显异常。本实验明确了昆明小鼠和DBA/2小鼠2种L1210细胞系白血病模型的生物学特性，为后续L1210白血病细胞体内迁移过程及侵袭部位的研究奠定了基础，可以针对不同的研究目的和不同的实验周期来选择合适的实验模型。