淫羊藿苷对体外牙周膜细胞增殖、成骨分化以及成骨和破骨因子表达的影响

李雪，朱勇，王丹杨，张耀超

西安医学院 口腔医学院，陕西 西安 710021

牙周炎是一种局部牙周组织慢性炎症性疾病，主要临床表现为牙龈炎症、出血、牙槽骨吸收、牙齿松动移位，严重者出现牙齿的自行脱落。牙周组织的重建和修复是长期以来口腔医生广泛关注的临床重点和难点话题[1]。牙周膜细胞作为牙周组织中最主要的细胞群，由成纤维细胞、成骨细胞、上皮细胞和间充质细胞等成分组成。牙周膜细胞具有向成骨和成牙骨分化的潜能，参与调节牙槽骨再生，因此被认为是牙周疾病组织工程研究的重要种子细胞[2]。淫羊藿苷是一种小檗科淫羊藿属植物，长期以来被用作补肾壮阳、抑菌消炎、抗衰老等用途[3-4]。近年来，淫羊藿苷也被证实能够显著抑制骨质疏松的发生和发展，对抗机体的骨衰退进程，并且能够显著加速局部的骨折和骨缺损修复[5-7]。但是，淫羊藿苷对于牙周膜细胞的生物学活性以及成骨分化潜能的影响尚未被系统阐明。本研究旨在通过体外分离培养人原代牙周膜细胞，探索淫羊藿苷对于人牙周膜细胞增殖、分化以及成骨和破骨因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

淫羊藿苷、胰蛋白酶购于Sigma公司；胎牛血清、α-MEM细胞培养基、青/链霉素双抗、无菌PBS购于Gibco公司；MTT细胞增殖检测试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒、RIPA裂解液购于碧云天生物技术公司；TRIzol购于Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒购于天根生物技术公司；BCA蛋白定量试剂盒购于Pierce Chemical公司；OCN（骨钙素）、Runx2（Runt相关转录因子2）、BMP2（骨形态发生蛋白2）、RANKL（核因子κB受体活化因子配体）抗体购于Abcam公司；辣根过氧化物酶标记二抗购于Bioworld公司；多功能酶标仪（Infinite M200）购于TECAN公司；紫外分光光度计（SmartSpec Plus）、PCR 仪（T100 thermal cycler）、半干转膜仪（Trans-Blot SD System）、凝胶成像系统（Bio-Rad Gel Doc XR+）购于Bio-Rad公司；倒置显微镜（LEICA DM LA）购于Leica公司；细胞培养箱（Thermo 3110）购于Thermo公司；低温高速离心机（Sigma 3-18K）购于Sigma公司。

1.2 人牙周膜细胞的体外分离与培养

选取因正畸治疗而需要拔除健康前磨牙的12～16岁青少年患者（无炎症和龋齿），将其拔除的前磨牙进行原代牙周膜细胞的体外分离。将拔除的牙齿（＞20颗）立即浸没于含青/链霉素双抗的α-MEM培养基中，反复漂洗后，刮取牙根中1/3的牙周膜组织，用无菌眼科剪将组织剪碎成约0.5 mm×0.5 mm大小的组织块，以阵列的形式均匀排布于培养瓶底部，在培养瓶中加入含10%青/链霉素、10%胎牛血清的α-MEM细胞培养基，倒置培养瓶，置于培养箱中12 h，随后翻转培养瓶继续培养，隔天换液。生长至第3～5代的细胞用于实验。

1.3 淫羊藿苷干预与实验分组

取第3～5代的原代牙周膜细胞，在传代培养的12 h后进行淫羊藿苷干预。整个实验分为实验组和对照组。实验组细胞加入0.01 mg/L淫羊藿苷溶液，对照组加入单纯成骨培养基。分别对细胞进行MTT细胞增殖检测、碱性磷酸酶活性检测，以及OCN、Runx2、BMP2和RANKL的基因和蛋白表达检测。

1.4 基于MTT法的细胞增殖检测

选取生长状态良好的牙周膜细胞制成浓度为1×105/mL的细胞悬液，以每孔100 μL将细胞悬液接种于96孔板中，检测前吸弃96孔板中的细胞培养基，用无菌PBS反复冲洗3～5次，随后在96孔板的每孔内加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育4 h，随后在96孔板的各孔内加入200 μL DMSO，37℃振荡孵育15 min，用Infinite M200 Pro酶标仪测定每孔样本的值。通过下式计算细胞抑制率：

1.5 碱性磷酸酶的检测分析

用无钙和镁的Hanks液清洗细胞，胰酶消化后收集细胞，加入0.2%的Nonidet P-40重悬浮细胞，冰浴中超声波裂解2 min，随后用碱性磷酸酶活性测定试剂盒检测牙周膜细胞中碱性磷酸酶的表达含量。

1.6 成骨和破骨因子的基因表达检测

在牙周膜细胞中加入异硫氰酸胍裂解细胞，用异硫氰酸胍-酚氯仿法提取总RNA，再用Super-ScriptⅢ反转录酶将提取的RNA合成为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix进行real-time PCR测定选取的基因，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及GAPDH（引物序列见表1）。每个样本上样至96孔板的3个复孔中，用2-ΔΔCt法进行目的基因的定量分析，使用内参基因β-actin对所有目的基因进行标准化处理。每个样本均重复3次real-time PCR，获得并计算其平均值。

表1 用于本研究的real-time PCR引物序列

1.7 成骨和破骨因子的蛋白表达检测

在牙周膜细胞中加入200 μL RIPA裂解液，待完全裂解后转移至4℃离心30 min。用蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量。蛋白经煮沸变性处理后进行电泳实验。配制10%的下层Tris-甘氨酸-SDS分离胶和5%的上层压缩胶，加入新鲜的电泳缓冲液，按照每孔40 μg蛋白提取物上样，在30 mA恒流条件下电泳。根据marker蛋白的相对分子质量将目的蛋白条带剪切，按照目的蛋白相对分子质量计算所需转膜时间（转膜电压20 V）。转膜毕，进行丽春红染色以评估电泳和转膜效果。随后，将PVDF膜封闭于含5%BSA的Tris盐溶液中1 h，与特定蛋白一抗的TBST溶液（含5%BSA）混合孵育4℃过夜，包括OCN、Runx2、BMP2、RANKL及β-tubulin。用TBST溶液洗涤3次后，将PVDF膜与1∶3000的HRP-conjugated二抗在室温下孵育1 h，用ECL化学发光系统直接对目标蛋白水平进行检测分析。用QuantityOne对蛋白的Western印迹结果进行半定量分析，检测蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

本研究中所有实验数据均采用x±s表示。用Windows版本的SPSS 20.0统计学分析软件对实验数据进行统计分析比较。对照组和药物组细胞的各参数指标的统计学差异均采用t检验进行分析，以P＜0.05作为有显著统计学差异的标准。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对人牙周膜细胞体外增殖速率的影响

通过MTT检测评估淫羊藿苷对人牙周膜细胞体外增殖速率的影响，结果如图1。加入淫羊藿苷的第3 d，实验组细胞的增殖速率较对照组提高了 36.8%（P＜0.05）；第5 d，实验组细胞的增殖速率同样显著高于对照组（P＜0.05），相比对照组提高了33.3%。结果提示淫羊藿苷干预能够显著提高体外人牙周膜细胞的增殖速率。

图1 MTT检测淫羊藿苷对人牙周膜细胞体外增殖速率的影响

2.2 淫羊藿苷对体外人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响

用碱性磷酸酶试剂盒检测评估淫羊藿苷对人牙周膜细胞体外分化速率的影响，结果如图2。在淫羊藿苷干预的第3 d，实验组的碱性磷酸酶活性显著高于对照组（P＜0.05），较对照组增加了45.2%；第5 d，实验组的碱性磷酸酶活性同样显著高于对照组（P＜0.05），较对照组增加了33.7%。结果提示，淫羊藿苷干预能够显著促进人牙周膜细胞的体外成骨分化潜能。

图2 碱性磷酸酶检测试剂盒评估淫羊藿苷对人牙周膜细胞体外成骨分化速率的影响

2.3 淫羊藿苷对人牙周膜细胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表达的影响

图3 Real-time PCR检测淫羊藿苷对体外人牙周膜细胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表达的影响

通过real-time PCR检测评估淫羊藿苷对体外人牙周膜细胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL基因表达的影响，结果如图3。加入淫羊藿苷的实验组中人牙周膜细胞成骨相关的OCN、Runx2、BMP2基因表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），表达水平分别增加了250.4%、321.6%、552.3%；同时，实验组中人牙周膜细胞的破骨相关RANKL基因表达显著低于对照组（P＜0.05），相比对照组降低了75.3%。结果揭示，淫羊藿苷干预能够显著上调人牙周膜细胞的体外成骨相关因子OCN、Runx2、BMP2的基因表达，并显著下调破骨相关因子RANKL的基因表达。

2.4 淫羊藿苷对人牙周膜细胞OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表达的影响

通过Western印迹检测评估淫羊藿苷对体外人牙周膜细胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表达的影响，结果如图4。在淫羊藿苷作用下，人牙周膜细胞中的成骨相关因子（OCN、Runx2和BMP2）的蛋白表达水平相比对照组分别增加了110.3%、191.4%、262.0%，均具有统计学差异（P＜0.05）；实验组人牙周膜细胞破骨相关RANKL蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.05），相比对照组降低了47.1%。以上结果表明淫羊藿苷能够显著增加人牙周膜细胞的体外成骨相关因子OCN、Runx2、BMP2的蛋白表达，并抑制破骨相关因子RANKL的蛋白表达。

图4 Western印迹检测淫羊藿苷对体外人牙周膜细胞中OCN、Runx2、BMP2和RANKL蛋白表达的影响

3 讨论

我国中医药资源丰富，历史悠久，且中药具有毒副作用小、取材广泛、药效明显的特点。小檗科草本植物淫羊藿是传统的补肾中药。《本草纲目》记载，淫羊藿具有“益精气、坚筋骨、实腰膝、强心力”之功效。现代药理研究表明，淫羊藿属植物的化学成分主要为黄酮、木脂素、生物碱和多糖，此外还有挥发油、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸等。黄酮类化合物为淫羊藿的主要有效成分，而淫羊藿苷是淫羊藿的主要黄酮类成分，是淫羊藿及其制剂质量控制的主要指标。淫羊藿苷具有免疫调节、补肾壮阳、抗肿瘤、抗菌消炎多种生物药理作用[8-9]。

十余年来，淫羊藿苷对于骨代谢和骨质疏松的作用效果得到了学者们的广泛关注。研究发现，淫羊藿苷能够显著抑制骨质疏松动物的骨丢失进程，并显著改善骨质疏松动物的骨质量[10]。而淫羊藿苷对于加速骨损伤修复和骨不连的延迟愈合的积极效应也有一些文献报道[11-12]。体外实验发现，淫羊藿苷可以显著促进体外骨髓基质细胞的成骨性分化和成骨细胞的分化成熟[13-14]。同时，也发现淫羊藿苷能够促进成骨细胞的增殖、成熟、成骨分化和新骨矿化基质形成能力[15]。并且，淫羊藿苷也被证实能够显著抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性[16]。但是，淫羊藿苷对于牙周膜细胞活性和分化潜能的调控作用及机制目前尚未被系统阐明。

牙周膜细胞作为牙周组织中最多且最重要的细胞群，在牙周组织的损伤修复与再生中发挥至关重要的作用。尤其对于牙周炎患者，牙周膜组织的结构退化和牙周膜细胞的活性功能损伤是诱发其牙齿功能损伤的重要因素。而牙周膜细胞群也被认为是牙周组织工程研究的最重要种子细胞类型之一。本研究的MTT结果揭示，我们的原代细胞经过淫羊藿苷干预后表现出更高的增殖速率。淫羊藿苷显著增加了人牙周膜细胞的细胞数量，而细胞群数量的增加不仅在一定程度上反映了细胞活性的促进效应，并且对于牙周膜细胞趋向成骨细胞的定向分化的促进具有积极效应。碱性磷酸酶是由骨质中成骨细胞分泌的，反映骨质中钙盐水平和机体钙吸收能力的酶类，其活性反映成骨细胞的活性和功能状况，并能够代表成骨分化的趋势[17]。我们的研究揭示3、5 d的淫羊藿苷干预均能显著提高牙周膜细胞的碱性磷酸酶表达水平。表明淫羊藿苷能够显著促进牙周膜细胞向成骨细胞的定向分化潜能，并提升其中成骨细胞的细胞活性和功能状况。

OCN主要由成骨细胞合成并分泌，在机体骨钙代谢中发挥关键作用，能够反映成骨细胞的成熟、分化和成骨能力[18]。Runx2作为骨组织中最重要的转录调控因子，在成骨细胞产生和成熟中发挥重要的调节作用[19]。BMP2是一种具有强诱导成骨分化能力的信号分子，也被认为是成骨细胞活性和功能的重要标志物[20]。我们的realtime PCR和Western印迹结果均揭示，淫羊藿苷干预后牙周膜细胞的OCN、Runx2和BMP2基因和蛋白表达水平均显著性增加。这进一步证明淫羊藿苷能够显著促进牙周膜细胞向成骨细胞的定向分化能力，并促进成骨细胞的成熟和新骨形成功能。

RANKL是一种促进破骨细胞形成和成熟的调控因子，主要与破骨细胞膜上的RANK结合启动破骨细胞胞内的信号转导通路。RANKL是反映骨组织中破骨细胞活性和骨吸收功能的细胞因子[21]。我们的研究发现，淫羊藿苷作用后，体外牙周膜细胞中的RANKL表达水平显著降低。这一结果提示淫羊藿苷作用后牙周膜细胞中的噬骨（骨吸收）能力被显著减弱，进一步证实了淫羊藿苷对于骨合成和分解代谢的双向调节作用。

综上所述，本研究表明淫羊藿苷能够显著促进体外人牙周膜细胞的增殖和定向成骨分化潜能，并能够上调成骨相关的OCN、Runx2和BMP2的基因和蛋白表达，显著抑制破骨相关的RANKL的基因和蛋白表达。本研究不仅可为牙周炎的药物治疗提供实验依据，也能为基于组织工程技术的牙槽骨和牙周组织的损伤修复再生提供新思路。