基于纳米抗体CDR3区抗原表位展示制备生存素抗体及其鉴定

王蕾，霍景瑞，张国安，贾力，杨晓晖，张晶晶，刘颖，刘英富，1b

1.沧州医学高等专科学校 a.病原生物与免疫学教研室，b.科技实验中心，河北 沧州 061001；2.沧州市纳米抗体技术创新中心，河北 沧州

抗体作为抗原可以刺激机体产生针对抗体的抗体，这类具有抗原作用的抗体也称为抗原化抗体[1]。抗体作为抗原刺激机体产生免疫反应，与其结构的互补决定区（complementarity determining region，CDR）密切相关，CDR变化程度高，氨基酸序列多样，该区不但是结合抗原的关键位置，同样也是抗体具有免疫原性的基础。传统抗体改造后作为抗原进行抗体的制备研究，已有相关的研究报道[2-3]，而传统抗体由于分子大，制备工艺复杂，同时作为抗原免疫后非特异性抗体产生种类较多，增加了后续筛选难度。纳米抗体作为一种新型的小分子抗体，可用来展示抗原表位，有望发挥更大的作用。

纳米抗体来源于骆驼重链抗体。与传统抗体结构不同，骆驼重链抗体只含有2条重链，不存在轻链，重链抗体的可变区是抗原结合的核心，单独具有结合抗原的能力，纳米抗体即为骆驼重链抗体的可变区序列，结构上同样存在互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，有着很好的抗原结合能力，在诊断、治疗等很多领域得到应用[4-6]。有关纳米抗体能否用来展示抗原表位，进行抗体制备，少有研究报道。生存素（survivin）是一种肿瘤凋亡抑制蛋白，在恶性肿瘤中的表达具有高度特异性，与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，该靶点具有很好的诊断、治疗价值。本研究选择生存素部分表位加入CDR3，探讨纳米抗体抗原表位的展示功能。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：scxk（京）2014-0004］；宫颈癌细胞株HeLa、Nb-SurvivinE偶联凝胶介质购自天津泰科迪恩生物科技有限公司；大肠杆菌BL21（DE3）、pET24a表达载体为本实验室保存；生存素由本实验室表达纯化；展示生存素N端表位（氨基酸序列1～15）的纳米抗体（Nb-SurvivinE）基因由北京中美泰和生物科技有限公司合成；内切酶、胶回收试剂盒、DNA连接酶、DL2000 DNA marker、蛋白 marker、兔抗小鼠二抗均购自北京康为世纪生物科技有限公司；免疫佐剂购自Sigma公司。

1.2 生存素表位选择与Nb-SurvivinE基因合成

前期实验室完成驼外周血淋巴细胞采集、分离，设计引物扩增并测序得到多个纳米抗体序列，随机选择其中一个作为表位展示载体。通过基因合成的方式将生存素N端1～15氨基酸插入纳米抗体CDR3，合成含生存素N端表位的纳米抗体Nb-SurvivinE基因，合成的基因含EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点。

1.3 Nb-survivinE原核表达载体构建、表达、纯化

将合成的Nb-SurvivinE基因、原核表达载体pET24a分别用内切酶进行双酶切，酶切产物分别用胶回收，用连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，将鉴定阳性的宿主菌进一步测序鉴定，测序正确的样品于37℃振荡培养，当菌液D600nm达到0.8时，加入0.1 mmol/L IPTG诱导，4 h后结束诱导，收集样本超声处理，将超声后的上清、沉淀进行SDS-PAGE，根据蛋白的表达结果，大量制备Nb-SurvivinE抗原，用His标签金属螯合亲合层析填料纯化。

1.4 Nb-SurvivinE免疫及血清效价检测

用Nb-SurvivinE抗原免疫6～8周雌性BALB/c小鼠，100 μg/只，初次免疫用弗氏完全佐剂蛋白乳化，腹腔注射，初次免疫后第14、21、28、35 d，用弗氏不完全佐剂蛋白乳化，腹腔注射，最后一次免疫1周后，取血检测效价，效价达1∶100 000以上，视为免疫成功。

1.5 Nb-survivinE多抗纯化及效价检测

小鼠眼眶取血，离心收集上清并与结合缓冲液1∶1混合，用0.45 μm滤器过滤，Nb-SurvivinE偶联介质上样纯化，用结合缓冲液冲洗柱至检测器基线，用pH2.7的Glycine-HCl洗脱液洗脱，洗脱样品用1 mol/L pH9.0的Tris-HCl缓冲液快速中和，SDS-PAGE检测纯化效果，ELISA检测纯化抗体的效价，以未免疫的小鼠多抗作为对照。

1.6 Western印迹检测Nb-survivinE多抗特异性

检测样品包括Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液，以不含生存素表位的纳米抗体（Nb-C）做对照。SDS-PAGE结束后电转PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，以Nb-survivinE偶联介质纯化的抗体作为一抗（1∶10 000），4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，兔抗小鼠二抗1∶10 000稀释，37℃孵育1 h，PBST洗涤3次，加入发光液检测，未免疫血清为对照。

2 结果

2.1 Nb-SurvivinE载体构建及鉴定

通过基因合成的方式合成Nb-SurvivinE，即将生存素N端序列插入纳米抗体的CDR3，酶切连接后转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取4个菌落进行菌液PCR鉴定，结果其中1个未见条带，3个出现阳性条带，分子大小与预测值（396 bp）一致（图1）。3个阳性克隆中随机选取1个送检测序，测序结果正确。

图1 Nb-SurvivinE菌液PCR鉴定

2.2 Nb-SurvivinE表达及纯化

Nb-SurvivinE经原核表达IPTG诱导后，SDSPAGE结果显示在相对分子质量15×103位置有目的条带表达，经超声破碎处理，表达的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中（图2A），经包涵体洗涤，8 mol/L尿素裂解的蛋白进行His标签纯化，经5、10、20 mmol/L低浓度咪唑去除杂蛋白，100 mmol/L高浓度咪唑洗脱，得到纯度大于96%的目的蛋白（图2B）。

图2 Nb-SurvivinE表达（A）与纯化（B）的SDS-PAGE

2.3 Nb-survivinE血清效价检测

纯化的Nb-SurvivinE经复性处理后，免疫雌性BALB/c小鼠，免疫5次后，第6周小鼠眼眶取血，采用间接ELISA检测效价，免疫后的小鼠血清效价均可达到1∶512 000（图3）。

图3 Nb-SurvivinE免疫血清效价检测

2.4 Nb-SurvivinE免疫血清纯化及检测

用抗原偶联介质纯化免疫后的小鼠血清，得到抗Nb-SurvivinE多抗（pAn-Nb-SurvivinE），SDS-PAGE检测抗体纯化效果，能明显观察到重链、轻链2条带（图4A），纯化后的抗体经梯度稀释，抗体浓度约为0.02 ng/μL时仍能够检测到阳性反应（图4B）。

图4 Nb-SurvivinE抗体纯化（A）及检测（B）

2.5 Western印迹鉴定Nb-SurvivinE多抗特异性

将Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液依次上样，分别用纯化的pAn-Nb-SurvivinE多抗、Nb-SurvivinE免疫血清及对照血清进行检测。Western印迹结果显示pAn-Nb-SurvivinE能够特异性结合Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液中的生存素（图5A），Nb-SurvivinE免疫血清可以检测到与Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液的阳性反应（图5B），对照血清与上述样品均未反应。

图5 Western印迹检测Nb-SurvivinE抗体特异性

3 讨论

抗体是生命科学研究的重要工具，抗原免疫是激发机体抗体产生的主要方式。由于抗原种类、性质的多样性，也产生了多种抗体制备方法，抗原化抗体是抗原表位展示的一种方法。本研究采用纳米抗体展示抗原表位。与传统抗体比较，纳米抗体易于制备，同时，纳米抗体CDR3比传统抗体的相应区域长，弥补了轻链缺失造成的抗原结合力下降，较长的CDR3对抗体的免疫原性有重要贡献[7]。

本研究选择生存素作为靶基因。生存素是有丝分裂纺锤体相关蛋白，参与有丝分裂纺锤体功能与哺乳动物细胞凋亡的激活，与宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤发生、发展密切相关[8-11]。生存素结构中含有4个α螺旋、3个β折叠，螺旋和折叠不利于表位的展示，因此我们选择生存素中不含螺旋、折叠结构的N端起始氨基酸序列用来表位展示。通过基因合成方式，将生存素N端15个氨基酸序列插入纳米抗体的CDR3并进行原核表达。虽然纳米抗体具有很好的可溶性[12]，但本研究表达的含生存素表位的纳米抗体主要以包涵体形式存在，其原因可能与选择的表达载体有很大的关系，研究所选择的pET24a表达系统有很强的原核表达能力，表达量大、表达速度快，这可能是影响目的蛋白可溶性的主要原因。为了使生存素抗原表位尽可能以空间结构的形式存在，对包涵体进行了复性处理，并用复性的Nb-SurvivinE抗原免疫动物，获得了针对Nb-SurvivinE的多抗。

在对多抗的检测中，我们选择Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液进行特异性检测。Western印迹结果显示，Nb-SurvivinE偶联介质纯化获得的多抗仅能检测到Nb-SurvivinE、生存素、HeLa细胞裂解液阳性反应，而未纯化的免疫血清不但能够检测到上述3种样品，还可以检测出不含生存素表位的Nb-C对照纳米抗体，提示纳米抗体作为载体进行表位展示时，不但产生针对CDR3表位的抗体，还产生了针对纳米抗体其他部位的抗体。因此，纳米抗体用来进行抗原表位展示免疫应用时，如希望得到特异性高的抗体，仍须进一步进行单克隆抗体的筛选研究。。

综上所述，我们采用纳米抗体CDR3展示生存素抗原表位的方法，制备了针对完整生存素的抗体，初步证实了纳米抗体作为载体蛋白在抗原表位展示中的作用。纳米抗体其他可变区是否能够用来进行表位展示，多可变区同时进行表位展示是否具有更好的效果，需要更多的实验研究去证实。