GATA1通过上调NANOG促进胰腺癌肿瘤干细胞形成

常振宇，张亚楠，刘婕，丁丽华，刘荣

1.解放军总医院 肝胆外二科，北京 100853；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，90%以上为胰腺导管腺癌，其早期诊断困难，进展较快，生存期短，死亡率高[1]。据2015年中国恶性肿瘤发病和死亡数据统计显示，胰腺癌死亡率位居所有恶性肿瘤的第6位[2]。

胰腺癌具有侵袭性高、易发生转移和高度耐药的特点，其中肿瘤干细胞是造成这种现象的一个重要原因[3]。肿瘤干细胞是具有干细胞特性的癌细胞亚群，具有自我更新和多向分化能力，与肿瘤的发生、进展、复发及转移有着密切关系[4]。肿瘤干细胞有其特异的表面标志物；研究表明，胰腺癌中具有CD133+或CD44+/CD24+/EpCAM+标志的细胞有干细胞特性[5]。

肿瘤干细胞的形成与维持依赖于干性基因的调控，如OCT4、SOX2、NANOG 等[6]。NANOG基因最早发现于胚胎干细胞中，编码一种同源域转录因子，对维持干细胞的自我更新和分化能力起着关键作用[7]。近年来，有研究发现NANOG基因在肿瘤的发生发展中也发挥着重要功能。在结肠癌细胞中敲低NANOG表达会明显减弱细胞的成球能力、降低肿瘤干细胞的含量、抑制肿瘤的生长[8]；而在宫颈癌细胞在内的多种肿瘤细胞中，NANOG/Tcl1a/Akt信号通路的激活会增加肿瘤干细胞的含量，促进肿瘤的进展[9]。目前NANOG在胰腺癌中的作用相关研究较少，具体调控机制尚不明确。

GATA1是GATA转录因子家族成员，在红系细胞分化过程中起着至关重要的调控作用[10]。GATA1既往被认为是造血系统特异性表达的转录因子，但近期研究表明GATA1在实体肿瘤中也扮演着重要角色。在乳腺癌中，GATA1通过激活PAK5导致细胞的上皮间质转化，促进细胞的侵袭和转移[11]。我们前期研究也发现，GATA1可以通过调控Bcl-XL诱导胰腺癌细胞对吉西他滨耐药[12]。但GATA1与肿瘤干细胞的关系尚未见相关研究报道。

本研究中，我们通过构建GATA1过表达稳定细胞系，发现GATA1在调控胰腺癌肿瘤干细胞中的作用，进一步对其下游干性基因进行了筛选，并深入探究了其调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞PANC-1、SW1990购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；人胚胎肾细胞 293T，质粒 pCDH-GATA1-GFP、pcDNA-Flag-GATA1、pGL4.0、pRL-TK为本室保存；慢病毒包装系统pPack Packaging Plasmid Mix购于SBI公司；DMEM、RPMI1640培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；PCR扩增酶Pfu、反转录酶MMLV、qPCR试剂TB Green Premix购于TaKa-Ra公司；限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶购于NEB公司；兔抗人CD133偶联PE流式抗体购于eBioscience公司；兔抗人NANOG抗体购于Proteintech公司；辣根过氧化物酶偶联Flag抗体、β-actin抗体购于Sigma公司；转染试剂Megatran购于Origene公司；转染试剂Vigofect、双荧光素酶报告基因试剂盒购于Vigorous公司；染色质免疫共沉淀试剂盒购于Millipore公司；引物合成及测序由北京博迈德公司完成。

1.2 慢病毒包装及稳转细胞株获取

接种293T细胞于6 cm皿中，密度达到40%～60%为宜；取病毒包装质粒 pLP1 1.68 μg、pLP2 0.8 μg、pVSVG 1.12 μg及目的质粒 2 μg，加入无血清无双抗的DMEM稀释至400 μL，充分混匀后加入Megatran试剂20 μL，振荡混匀后室温静置10 min，逐滴加入培养液中，48～72 h后收取病毒上清。将PANC-1细胞接种于6 cm皿中，密度达到50%～70%为宜；取2 mL病毒上清液加入PANC-1细胞培养液中，48 h后换正常培养基；72 h后流式细胞分选GFP绿色荧光阳性的细胞，扩增培养得到稳转细胞株。

1.3 流式细胞检测

将PANC-1细胞和PANC-1-GATA1-GFP细胞接种于6孔板，密度为40%～60%，24 h后将细胞消化、重悬、离心，1×PBS洗2次后加入80 μL含3%牛血清的PBS重悬，各组细胞分别加入对照PE 染料和 CD133-PE抗体 10 μL，4℃避光反应30 min，3000 r/min离心5 min收集细胞，用含3%牛血清的PBS洗2次后，加入400 μL含3%牛血清的PBS重悬，上机检测。

1.3 质粒瞬时转染

接种PANC-1细胞或SW1990细胞于6孔板，密度50%～70%为宜；吸取转染试剂Vigofect 2 μL，用生理盐水稀释至100 μL，混匀后室温静置5 min；取质粒3 μg，用生理盐水稀释至100 μL，与稀释后的Vigofect混匀，室温静置15 min；将得到的工作液逐滴加入培养基中，4～6 h后换液，24～48 h后收取细胞进行后续实验。

1.4 RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR

弃去培养基后用1×PBS清洗，加入1 mL PBS刮取细胞，3000 r/min离心5 min收集细胞，TRIzol裂解细胞，氯仿分层，异丙醇沉淀，乙醇清洗，干燥后DEPC处理水溶解，得到总RNA，测定浓度及纯度后进行反转录。反转录体系包括RNA 2 μg、oligo（dT）1 μL，加水 至 15.9 μL，70℃反应5 min，立刻置于冰上，加入MMLV 1 μL、5×MMLV 缓冲液 5 μL、dNTP 2.5 μL，RNase抑制剂0.6 μL，充分混匀，42℃反转录 1 h，95℃5 min灭活反转录酶，得到cDNA第一链，稀释至100 μL。实时荧光定量PCR体系为TB Green Premix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 模板9.2 μL；每组设置3个重复孔，β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。qPCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物

1.5 Western印迹检测NANOG表达

收取对照及GATA1过表达细胞，用加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，冰上反应30 min后加入等体积2×SDS上样缓冲液，沸水中变性15 min，12 000 r/min离心1 min，上样进行SDS-PAGE，蛋白样品充分分离后，采用半干转膜法将蛋白转印到硝酸纤维素膜，TBST配制5%的脱脂奶粉封闭30 min，孵育兔抗人NANOG抗体（Flag抗体及β-actin抗体同时孵育，4℃孵育过夜），TBST洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG室温孵育1 h，TBST洗膜，化学发光法显影。

1.6 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重组质粒的构建

在UCSC Genome Brower网站查询NANOG基因启动子-1000～+50 bp序列，设计上游引物（5'-GGGGTACCAGACATGACAAATCACCAGAC-3'，酶切位点为KpnⅠ）和下游引物（5'-CCCAAGCTT GGCTCTATCACCTTAGACCCAC-3'，酶 切 位 点 为HindⅢ），以人胰腺癌细胞PANC-1基因组为模板进行PCR扩增钓取启动子片段，反应体系包括上下游引物各1 μL、Pfu0.5 μL、10×缓冲液5 μL、dNTP 1 μL、模板 1 μL，补水至 50 μL。回收扩增片段，与pGL4载体分别经KpnⅠ/HindⅢ双酶切过夜，回收酶切载体与片段，用T4DNA连接酶连接1 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板后37℃培养过夜，挑取单克隆进行PCR鉴定（上游引物为5'-GACATGACAAATCACCAG AC-3'，下游引物为5'-GGCTCTATCACCTTAGAC CCAC-3'），选取阳性克隆扩增，提取质粒，KpnⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，阳性质粒送公司测序。

1.7 双萤光素酶报告基因实验

接种PANC-1和SW1990细胞于24孔板，转染前密度达到50%～70%，将空载体或pcDNA-Flag-GATA1与pRL-TK质粒共转染细胞，24～48 h后收取细胞，按试剂盒操作指南裂解细胞，依次测定萤火虫萤光素酶活性和海肾萤光素酶活性，海肾萤光素酶活性作为内参，计算相对活性值。

1.8 染色质免疫共沉淀（ChIP）

PANC-1细胞接种于10 cm培养皿，弃去培养基，PBS清洗后加入新鲜配置的1%甲醛溶液固定10 min，刮取细胞后3000 r/min离心5 min，弃上清，按试剂盒说明书依次裂解细胞、核裂解、超声破碎、稀释、加入磁珠，在所得样品中加入GATA1抗体或对照IgG，4℃结合过夜，依次进行清洗、洗脱、纯化得到DNA片段，以所得DNA片段为模板进行实时荧光定量PCR，所用引物序列见表2。

1.9 统计分析

统计分析软件为SPSS 23.0；实验数据中连续变量均以x±s表示，2组之间比较采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

表2 ChIP qPCR引物

2 结果

2.1 GATA1过表达细胞株中肿瘤干细胞含量增加

我们构建了GATA1过表达的稳定转染细胞株，用流式细胞术检测了对照及GATA1过表达细胞中CD133+细胞的含量，发现GATA1过表达细胞株中CD133+细胞比例明显增加（图1）。CD133是胰腺癌肿瘤干细胞特异性的表面标志物，这说明在GATA1过表达细胞株中胰腺癌干细胞含量增加。

图1 对照及GATA1过表达细胞中肿瘤干细胞的比例

2.2 GATA1下游干性基因的筛选

采用实时定量PCR检测了对照及GATA1过表达PANC-1细胞中干性基因的mRNA表达水平，结果如图2，瞬时转染GATA1之后，NANOG、BMI-1和C-MYC的mRNA水平上调，其中NANOG的上调幅度较大，说明NANOG可能是GATA1直接调控的下游干性基因。

图2 GATA1下游干性基因的筛选

2.3 GATA1上调NANOG的mRNA和蛋白表达

基于以上结果，我们进一步验证了GATA1对NANOG蛋白表达水平的影响。在PANC-1和SW1990细胞中过表达GATA1后，qPCR检测NANOG mRNA表达，Western印迹检测NANOG蛋白表达，结果显示NANOG过表达细胞的mRNA和蛋白表达水平都相应上调（图3）。

2.4 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重组质粒鉴定

GATA1作为转录因子，主要通过结合在下游基因的启动子上发挥作用。因此，我们从胰腺癌基因组中钓取了NANOG启动子-938～-3 bp片段（图4A），并构建至萤光素酶报告基因，PCR鉴定和双酶切鉴定可见片段大小正确（图4A），测序比对发现序列正确（图4B），说明pGL4-NANOG promotor-Luciferase重组质粒构建成功。

2.5 GATA1增强NANOG启动子的活性

将空载体或GATA1过表达载体与构建的萤光素酶报告基因共同转染PANC-1和SW1990细胞，测定双萤光素酶活性，结果见图5，GATA1过表达组NANOG启动子的活性明显高于对照组，说明GATA1结合在NANOG启动子上调控其转录。

2.6 GATA1结合在NANOG启动子-527～-524 bp的GATA序列

为探究GATA1在NANOG启动子上具体的结合位点，根据GATA1结合DNA的序列特点，预测出A、B、C、D等4个可能的结合位点（图6A），并针对这些位点设计了相应的引物。染色质免疫共沉淀结果（图6B）显示，GATA1主要募集在NANOG启动子的B位点，在A、C、D位点均无募集，说明GATA1结合在NANOG启动子的B位点，即-527～-524 bp处的GATA序列上。

图3 GATA1上调NANOG的mRNA和蛋白表达

图4 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重组质粒鉴定

图5 GATA1增强NANOG启动子活性

图6 GATA1在NANOG启动子上的结合位点鉴定

3 讨论

肿瘤干细胞是肿瘤细胞中比例较低的一个亚群，在肿瘤的发生、耐药、复发和转移过程中发挥着主要作用[4]。肿瘤干细胞的存在最初发现于急性髓性白血病中[13-14]，在实体肿瘤中首先在乳腺癌中被证实。2003年Al-Hajj等报道乳腺癌细胞中的细胞具有干细胞特性，在裸鼠体内具有极强的肿瘤形成能力[15]；后续相关研究陆续发现了胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌中的肿瘤干细胞标志物[16-18]。2007年，Li等和Hermann等首次确定了胰腺癌中肿瘤干细胞的存在，发现细胞亚群具有干细胞特性[19-20]；近年有研究报道CXCR、c-MET、ALDH1等也是胰腺癌肿瘤干细胞的标志物[21]。我们通过流式细胞术发现GATA1过表达的胰腺癌稳定细胞株中CD133+细胞比例升高，这说明GATA1过表达可以增加胰腺癌细胞中肿瘤干细胞的含量。

肿瘤干细胞的形成和维持过程涉及多个通路，如Notch 通路、Hedgehog通路、Wnt通路等[22]；其中多个基因发挥着重要功能，如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-MYC等[4]。NANOG基因是维持胚胎干细胞的多能分化性的关键基因，在正常的体细胞中表达量很低，但在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中表达上调[23]。目前多项研究表明NANOG表达水平的上调与肿瘤的发生、进展、耐药、复发和转移相关，同时NANOG的表达水平与多种肿瘤病人的预后相关[24]。肿瘤中NANOG的表达水平受到多种分子的调控，在肝癌细胞中磷酸化的STAT3可以上调NANOG的表达，从而促进细胞生长[25]；在胶质瘤中，Hedgehog-Gli通路可以通过调控NANOG的表达影响肿瘤干细胞的含量[26]。目前，在胰腺癌中NANOG的调控机制研究较少。在本研究中，我们通过实时荧光定量PCR检测了GATA1过表达细胞中干性基因的表达，发现NANOG的水平明显上调，又进一步从蛋白水平进行了验证，结果显示GATA1可以上调NANOG的表达。

GATA1转录因子包含2个锌指结构，C端锌指结构可以结合GATA序列，N端锌指可以结合GATC序列，发挥转录调控作用[27]。我们构建了包含NANOG启动子的萤光素酶报告基因，发现GATA1可以促进NANOG启动子的活性；我们针对启动子序列上的GATA和GATC位点设计了相应的引物，通过染色质免疫共沉淀实验，证实了GATA1结合在NANOG启动子-527～-524 bp的GATA序列上。

本研究结果说明GATA1可以上调胰腺癌中肿瘤干细胞的含量，同时GATA1可以通过结合在NANOG启动子上促进其表达。结合既往研究报道中的结果——敲低NANOG抑制胰腺癌干细胞的干性[28]，推论GATA1可以通过NANOG调控胰腺癌肿瘤干细胞的含量，但仍须进一步的功能实验验证。

综上，本研究发现了GATA1在调控胰腺癌肿瘤干细胞中的功能，并且明确了GATA1调控干性基因NANOG的具体机制，为探讨胰腺癌发生发展的分子机制提供了新的证据，为寻找新的有效治疗靶点奠定了基础。