食品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质同时检测方法的建立

孔凡华,张一凡,郭 倩,李菁菁,赵 祯,木其尔,田荣荣,崔亚娟,*

(1.北京市营养源研究所,北京市系统营养工程技术研究中心,北京 100069;2.北京城市学院生物医药学部,北京 100083)

类胡萝素是一类广泛存在于植物、真菌、藻类和细菌中的黄色、橙红色或红色色素,目前在自然界已经鉴定出来700多种[1]。其中叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质等为当前广受关注的典型类胡萝素,主要存在于天然果蔬中[2],在人体健康中扮演了重要的角色,具有很多生理功能[3]。如叶黄素、玉米黄质具有较强抗氧化性[4],能够清除自由基的影响,提高免疫功能,减少患慢性病[5]、癌症[6]等的风险,可以预防和治疗糖尿病[7],有效减少蓝光对视网膜的伤害,预防年龄相关性黄斑变性等病症[8]。叶黄素已经广泛应用于医药、保健品、食品、化妆品、饲料等领域[9]。

叶黄素的分析检测方法主要有:紫外-可见分光光度法[10-11]、高效液相色谱法(HPLC)[12-13]、液相色谱质谱联用法[14-15]、红外光谱法[16-17]、超临界流体色谱法[18-19]、核磁共振法[20-21]等,在我国现行的国家标准中,叶黄素的分析方法为液相色谱法[22]。高效液相色谱法具有分离效果好、选择灵敏性强、分离速度快、可与多种技术联用等优点,是目前使用最广泛的对叶黄素进行定量分析的检测方法,也是定量分析玉米黄质和β-隐黄质的常用方法。

叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的提取方法有:室温皂化提取[23]、温水浴提取[24]、超声提取[24-25]、、冷丙酮提取[26]等,在提取过程中,叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质很容易发生氧化和结构异化,有必要建立快速温和的提取方法,对其进行更精确的定量。叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质共同存在于食品基质中,但同时将其分离和定量的相关研究较少。因此,建立食品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质同时检测技术具有重要的现实意义。本文在借鉴前人研究的基础上,利用高效液相色谱法建立了食品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的同时在线分析检测方法,以小米和大米为样品进行方法学验证,采用建立的方法对不同食品基质菊花、玉米、菠菜、橙子、鸡蛋样品进行叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的含量测定,旨在为科研和实际应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小米、菊花、玉米、菠菜、橙子、鸡蛋等样品 市购;叶黄素标准品(纯度≥97.0%)、玉米黄素标准品(纯度≥95.0%)、β-隐黄质标准品(纯度≥97.0%)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 美国Sigma公司;甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯(均为色谱纯) 美国Fisher公司;无水硫酸钠、乙醇、正己烷、环己烷、异丙醇、氢氧化钾、石油醚、抗坏血酸(均为分析纯) 北京化工厂;无水乙醚 国药集团化学试剂有限公司。

BS224S分析天平 德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司;EYELA N-1100旋转蒸发仪 东京理化株式会社;Thermo U-3000高效液相色谱仪 美国Thermo Fisher科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取溶剂的选择 准确称取5份2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 50%氢氧化钾水溶液,混匀。于50 ℃恒温振荡水浴锅内,避光振荡皂化30 min,取出立即冷却至室温。将5份皂化液分别用50 mL水转入250 mL分液漏斗中,每份样品加入一种提取溶剂,这5种溶剂分别是:50 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液、50 mL正己烷∶乙酸乙酯(7∶3)混合液、50 mL环己烷∶乙酸乙酯(2∶8)混合液、50 mL正己烷∶异丙醇(3∶1)混合液、50 mL环己烷∶乙酸乙酯(1∶1)混合液,振荡萃取5 min,将下层溶液转移至另一250 mL分液漏斗中,分别加入50 mL上述萃取溶剂重复萃取,每次用约100 mL水洗涤萃取溶剂层,重复洗涤3次,直至将萃取溶剂层洗至中性,去除下层水相。合并两次洗涤后的萃取溶剂层,经无水硫酸钠滤入150 mL旋转蒸发瓶内,用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,将蒸发瓶接在旋转蒸发仪上,40 ℃水浴减压蒸馏,待瓶中萃取液剩下约2 mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用2 mL含0.1% BHT的乙醇溶液定容。溶液过0.45 μm有机系滤膜后,按下述高效液相色谱条件测定。

1.2.2 前处理条件的选择

1.2.2.1 碱溶液的选择 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液,分别加入10 mL 10%氢氧化钾水溶液、10 mL 20%氢氧化钾水溶液、10 mL 50%氧化钾水溶液、10 mL 60%氢氧化钾水溶液、10 mL 10%氢氧化钾甲醇溶液、10 mL 30%氢氧化钾甲醇溶液混匀。于50 ℃恒温振荡水浴锅内,避光振荡皂化15 min,取出立即冷却至室温。分别用100 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步骤同1.2.1。

1.2.2.2 皂化温度的选择 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氢氧化钾水溶液,于25、50、75 ℃恒温振荡水浴锅内避光振荡皂化15 min,取出立即冷却到室温。分别用100 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液提取,其他操作步骤同1.2.1。

1.2.2.3 皂化时间的选择 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液,加入10 mL 60%氢氧化钾水溶液,于50 ℃恒温振荡水浴锅内,避光振荡皂化5、10、15、30、45和60 min,取出立即冷却至室温。分别用100 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)其他操作步骤同1.2.1。

1.2.3 不同前处理方法比较研究

1.2.3.1 国标方法 准确称取2.0 g均匀小米于50 mL离心管中,以10 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液萃取溶剂,避光涡旋振荡提取3 min,4500 r/min离心3 min,重复提取2次,合并提取液,于室温减压浓缩至近干,以3 mL萃取溶剂涡旋振荡溶解,重复操作1次,合并萃取溶剂,混匀,以约1 mL/min的流速过已活化的中性氧化铝固相萃取小柱,用3 mL萃取溶剂洗脱,合并流出液与洗脱液,于室温减压浓缩至近干,以0.1% BHT乙醇溶液,涡旋振荡溶解残渣并定容至10 mL,过0.45 μm滤膜,供液相色谱测定。

1.2.3.2 超声提取方法 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氢氧化钾水溶液,混匀。常温避光超声提取30 min,其他操作步骤同1.2.1。

1.2.3.3 实验建立方法 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60%氢氧化钾水溶液,混匀。于50 ℃恒温振荡水浴锅内避光振荡皂化15 min,取出立即冷却到室温,其他操作步骤同1.2.1。

1.2.4 方法学验证实验

1.2.4.1 标准曲线的绘制 准确称取叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质标准品1 mg(精确到0.1 mg),用丙酮定容至25 mL棕色容量瓶中,临用前在波长445 nm处用丙酮作空白于分光光度计上标定溶液浓度。

准确吸取叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质标准储备溶液,配制成不同浓度梯度的叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质标准溶液,以浓度为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。

1.2.4.2 方法精密度实验 准确称取2.0 g均匀小米于250 mL三角瓶中,加入30 mL 含0.1% BHT的乙醇溶液和10 mL 60% 氢氧化钾水溶液,混匀。于50 ℃恒温振荡水浴锅内避光振荡皂化15 min,取出立即冷却至室温,其他操作步骤同1.2.1,连续测定6次(n=6),验证方法的精密度。

1.2.4.3 方法准确度实验 取大米样品,测定样品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质含量,结果均小于检出限,以大米为空白样品,进行三个标准添加水平的回收率试验,每个添加水平重复测定3次,分别计算加标回收率和相对标准偏差。

1.2.5 色谱条件 色谱柱:YMC C30(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为二氯甲烷∶乙腈∶甲醇(2∶3∶5);检测波长:445 nm;柱温:30 ℃;进样体积:20 μL。

1.2.6 含量的测定 叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质含量按下式测定:

式中:X为样品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的提取量,μg/100 g;c为由标准曲线而得的试样溶液中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的浓度,μg/mL;V为试样溶液最终定容体积,mL;m为试样质量,g。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优化

由于溶剂的极性差异、皂化液与各种提取剂的互溶性及分散状况不同,不同萃取液对叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的溶解能力不同。强极性溶剂与弱极性溶剂混合后溶液的极性更容易与叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的极性接近,进而溶解更多的叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质,所以,混合溶剂比单溶剂对叶黄素的提取效果更好[27]。由表1知,小米中未检测到β-隐黄质;正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液对小米中叶黄素和玉米黄质的萃取效果最佳,故选择正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液作为实验提取溶剂。

表1 不同提取溶剂测定结果

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 碱溶液的优化 由表2可知,随碱浓度的增加,叶黄素和玉米黄质的含量呈现递增趋势;当碱溶液浓度小于 60%时,叶黄素酯分散性不好,影响皂化反应进行,使叶黄素含量低;当碱溶液浓度为60%时,叶黄素的含量达到最大值,故选择60%氢氧化钾水溶液作为实验皂化溶液。

表2 不同碱溶液皂化测定结果

2.2.2 皂化温度的优化 由图1可知,25 ℃皂化后叶黄素和玉米黄质的含量小于50 ℃,这是因为温度升高,可以加快叶黄素酯转化成游离叶黄素的效率。随着温度的升高,叶黄素和玉米黄质的含量减少,这是由于皂化温度过高会导致叶黄素和玉米黄质的分解。因此,皂化温度控制在50 ℃为宜。

图1 不同皂化温度测定结果

2.2.3 皂化时间的优化 由图2可知,5～5 min之内随着皂化时间的延长,体系中叶黄素和玉米黄质的含量逐渐升高,在15 min时叶黄素含量达到最高,在15 min后叶黄素含量下降。说明15 min后,皂化反应生成叶黄素和玉米黄质的速度小于叶黄素和玉米黄质的降解速度。所以,皂化时间选择15 min最佳。

图2 不同皂化时间测定结果

2.3 不同前处理方法比较研究

由图3可知,实验建立的方法叶黄素提取率比超声方法提高3.81%,比国标方法提高24.74%;玉米黄质提取率比超声方法提高0.78%,比国标方法提高11.08%。可见,实验建立的方法可以实现叶黄素、玉米黄质的快速温和提取,对天然食品基质中叶黄素和玉米黄质的提取效果优于超声提取方法和国标方法。

图3 不同前处理方法测定结果

2.4 方法学验证实验

2.4.1 标准曲线的绘制 由图4可知,叶黄素在0.2342～9.3689 μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=3.8333x,相关系数R2=0.9999;玉米黄质在0.3004～12.0167 μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=4.7156x,相关系数R2=0.9999;β-隐黄质在0.3734～14.9371 μg/mL范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=3.7526x,相关系数R2=0.9996。叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质高效液相色谱图见图5。

图4 标准曲线绘制

图5 叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质标准谱图

2.4.2 方法精密度实验 由表3可知,平行测定6次,RSD均小于10%,表明方法的精密度良好,适合定量分析。

表3 方法精密度结果

2.4.3 方法准确度实验 由表4可知,叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质加标回收率在85.6%～98.8%之间，平均加标回收率分别为90.3%、91.7%、90.5%,加标回收率的相对标准偏差分别为4.51%、7.60%、5.84%。能够满足检测实际样品的检测需要。

表4 加标回收率实验结果

2.5 食品中叶黄素含量的测定

选择菊花、玉米、菠菜、橙子、鸡蛋等叶黄素含量较高的天然食品基质,用本实验建立的方法测定食品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的含量,结果见表5。

表5 不同食品中叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的含量

由表5可知,菊花中叶黄素含量最高,菠菜中次之,菠菜和玉米中玉米黄质含量较高,橙子和玉米中β-隐黄质含量较高。

3 结论

本实验优化了叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质的前处理条件,最终确定最优前处理条件为:试样中加入30 mL含0.1%的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)乙醇溶液和10 mL 60%氢氧化钾水溶液,置于恒温水浴箱内50 ℃振荡皂化15 min,处理样液用100 mL正己烷∶乙醚∶环己烷(2∶2∶1)混合液萃取。平行测定6次,叶黄素、玉米黄质的相对标准偏差(RSD)分别为1.41%、4.98%,加标回收率在85.6%～98.8%之间,表明该方法重现性良好、准确可行。本实验采用等度洗脱,12 min之内,叶黄素、玉米黄质和β-隐黄质出峰完全并得到较好的峰型,与国标方法和文献报道的梯度洗脱方法相比,色谱条件简单,易于操作,同时,缩短了分析时间,节约成本。

实验建立的方法叶黄素提取率比超声方法提高3.81%,比国标方法提高24.74%;玉米黄质提取率比超声方法提高0.78%,比国标方法提高11.08%。可见,实验建立的方法对叶黄素、玉米黄质的提取效率更高,可以更加准确定量食品中叶黄素、玉米黄质的含量,弥补相关标准的不足和检测方法的缺陷,为企业、科研机构的科学研究和质量控制提供方法保障,给相关科研检测机构和监管部门提供技术支持,具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。