拉曼光谱技术在橄榄油掺伪及品质鉴定中的应用研究进展

黄 帅,王 强,应瑞峰,王耀松,胡飞杰,黄梅桂,,*

(1.南京林业大学轻工与食品学院,食品科学与工程系,江苏南京 210037;2.重庆第二师范学院,脂质资源与儿童日化品协同创新中心,重庆 400067;3.南京市产品质量监督检验院,食品与食品添加剂国家中心,江苏南京 210037)

初榨橄榄油是由初熟或成熟的油橄榄鲜果在采后24 h内通过物理压榨工艺提取的木本植物油,由于提取过程中不经过任何热及化学处理,橄榄油保留了其独特的营养成分与感官特性,因此受到广大消费者的喜爱。橄榄油的品质分析及掺伪鉴别一直是国内外研究的主题,目前市面上橄榄油的掺假主要分为两类:一是优质橄榄油中掺入劣质橄榄油、橄榄果渣油;二是在橄榄油中掺入其它种类的油。高效液相色谱、气相色谱、液相色谱串联质谱、气质联用等传统方法被广泛应用于食用油的安全性分析,然而,由于样品制备较为复杂且费时费力,这些方法难于应用于橄榄油生产过程中的在线监测。核磁共振(NMR)、近红外光谱(NIR)、拉曼光谱(RS)等光谱技术由于样品制备简单、分析速度快且灵敏度高,是橄榄油品质鉴定的有力工具。与吸收峰较宽的红外光谱不同,拉曼光谱的特征是一系列孤立的谱带,并且对C=C的灵敏度较高,更适合分析食用油。本文介绍了拉曼光谱在橄榄油品质分析及掺假鉴别中的研究现状,为橄榄油品质检测提供了有用的信息,并对其在橄榄油安全分析中的应用前景进行了展望。

1 拉曼光谱概述

拉曼光谱是以1928年印度物理学家拉曼发现的拉曼散射效应为基础发展起来的一种研究分子振动、转动的光谱技术,它基于特征峰强度与含量具有良好相关性,且灵敏度高,是一种快速、无损、无污染的检测技术。近年来,拉曼光谱技术的发展非常迅速,随着拉曼光谱仪和光纤探头的发展,拉曼光谱被应用到许多领域[1],食用植物油一直是拉曼光谱学研究的主题[2]。橄榄油是地中海饮食中脂肪的主要来源,是所有植物油中唯一以天然鲜果冷榨的食用植物油,并且与降低冠心病以及一些肿瘤的发病率有关,因而受到广泛关注。在过去的几十年里,光谱技术已经成为分析初榨橄榄油和其他类型植物油非常有利的工具,除红外光谱和核磁共振外,拉曼光谱因其优秀的指纹能力和操作的便捷性被运用于食用植物油的分析[3-8]。

1.1 橄榄油检测的研究现状

橄榄油是由初熟或成熟的油橄榄鲜果通过物理压榨工艺提取的天然果油,被认为是迄今唯一一种以自然状态形式供人类食用的木本植物油,其品质在植物油中居于首位。油橄榄在地中海沿岸已有四千多年的栽培历史,目前世界橄榄油主产国主要有西班牙、意大利、希腊等,我国于20世纪60年代开始引种橄榄树,主要分布于云南、甘肃、四川等省份[9-11]。近年来,随着生活水平的提高,人们越来越重视饮食的营养与健康,橄榄油也因其独特的营养价值获得了消费者的青睐。

目前对于橄榄油中成分及各项指标的检测方法主要有感官检验、常规理化检测、色谱检测技术、光谱检测技术等[12-14]。感官检验的方法虽然直观、快速,但是受感官分析平台及专业感官评定员的限制。常规理化检测主要包括过氧化值、酸值和碘值的测定。油脂的酸值主要反映了油脂中游离脂肪酸的含量,根据橄榄油、油橄榄果渣油标准(GB/T 23347-2009)[15],橄榄油的酸值(以氢氧化钾计)一般要求小于4 mg/g,而特级初榨橄榄油的酸值要求小于1.6 mg/g。其次,油脂的过氧化值、碘值也表征橄榄油的腐败程度。常规理化检测虽然结果比较准确,但是单一指标的测量不够客观,多指标的测量又比较复杂繁琐,只能作为鉴别橄榄油品质的有效辅助手段[16]。色谱检测技术主要包含了气相色谱、高效液相色谱等,气相色谱可用于橄榄油中的脂肪酸组成、含量、橄榄油中的生育酚、甾醇及一些风味物质和挥发性物质的检测。高效液相色谱可用于检测橄榄油中的多酚、黄酮类物质。色谱技术检测灵敏度高、结果准确可靠,但是仪器较为昂贵、前处理复杂、耗时[17]。

光谱检测技术是一种快速、简便且低碳环保的技术,包括紫外-可见分光光度法、原子吸收法、红外光谱法、拉曼光谱法等。目前食用油的检测应用较多的是红外光谱法和拉曼光谱法,红外光谱是分子振动过程中偶极矩变化引起的,而拉曼光谱是分子振动过程中极化率的变化引起的。与红外光谱相比,拉曼光谱的谱峰比较窄,指纹信息更加丰富,对C=C的检测具有很高的灵敏度[18-19]。在分析分子的结构时,拉曼光谱与红外光谱可以相互补充。一些红外光谱无法检测出来的信息可以在拉曼光谱中检测出来[20],C=O、N-H、O-H等极性基团的红外吸收较强,而C=C、C-C等非极性基团的拉曼谱带强度大,因此拉曼光谱与红外光谱配合使用可以更加全面地研究物质的结构[21-23]。

1.2 橄榄油的拉曼光谱特征信息

拉曼光谱是以拉曼散射效应为基础发展起来的一种分子振动光谱,它的谱带数目、频率位移、谱带强度都与分子的振动和转动相关联[24]。拉曼光谱研究的区域主要在800～1800和2750～3100 cm-1[25-26]。橄榄油的部分特征拉曼位移及特征峰所代表的官能团信息如表1所示[16,18,27],其中3005 cm-1是=C-H的对称伸缩振动峰;2924 cm-1处是C-H的不对称伸缩振动峰;2897和2850 cm-1是分别对应于CH3和CH2的C-H对称伸缩振动峰;1760 cm-1是C=O的伸缩振动峰;不饱和脂肪酸的顺式碳碳双键[cis(C=C)]的基团振动峰位于1660 cm-1处;1525 cm-1处是C=C的伸缩振动峰;1440和1300 cm-1是C-H弯曲振动峰;1265 cm-1是=C-H弯曲振动峰;1008 cm-1是CH3的弯曲振动峰;1150、1082和868 cm-1是C-C的伸缩振动峰;960 cm-1与反式碳碳双键[trans(C=C)]的弯曲振动相关。位移值为1265、1660和3005 cm-1处的拉曼峰与不饱和脂肪酸的碳碳双键有关[16,18]。这些带的强度主要反映了总不饱和度并且与油的碘值相关。大约在1008、1150和1525 cm-1处的三个带与类胡萝卜素有关[28-30],这是不同品牌橄榄油主要特性变化的原因之一。拉曼光谱是一种分辨结构的有效手段,它可以在短时间内测量大量的样品并且能够显示出良好的振动跃迁带。近年来,拉曼光谱在食品分析中的应用越来越广泛,特别是在食用植物油的分析方面,如:评估油的总不饱和度、橄榄油的品质的鉴定、检测初榨橄榄油中的掺假、确定橄榄油中的微量成分及评估氧化稳定性[26]。

表1 橄榄油中主要拉曼峰的归属[16,18,27]

2 应用拉曼光谱法评估橄榄油的品质及分类鉴定

2.1 拉曼光谱法可快速有效评价橄榄油的不饱和度

拉曼光谱最早用于食用油分析是用于测定油的不饱和度(DU),测量不饱和度的方法主要是碘值(IV)法,指100 g油所吸收的碘离子的量,通常用气相色谱法和Wijs碘法等化学方法来进行测定[26,31],然而这些传统的化学方法较为复杂繁琐,因此快速有效、操作简便的拉曼光谱法逐渐体现出优势[25,32-34]。由于不饱和度代表脂肪酸链中双键的数目,评价不饱和度的方法可通过定量测量ν(C=C)谱带强度及其与δ(CH2)剪切振动相关的谱带强度的关系,可通过1660和1440 cm-1附近谱带高度的比率来测定油脂的不饱和度[34-38]。

Bailey等[39]发现不饱和度与1620～1690 cm-1[ν(C=C)]和1420～1480 cm-1[δ(CH2)]范围内的拉曼谱带强度之间具有强相关性。El-Abassy等[40]使用1265和1300 cm-1处谱带的相对强度比来确定不饱和度。Sadeghi-Jorabchi等[37]使用傅里叶变换拉曼光谱技术(FT-RS)在约1650 cm-1[ν(C=C)]和1440 cm-1[δ(CH2)]以及3010 cm-1[ν(=C-H)]和1270 cm-1[γ(=C-H)或ν(C-C)]处观察到的谱带强度来确定油和人造黄油的碘值,发现五种油与人造黄油的ν(C=C)与δ(CH2)的峰高比与碘值具有很高的相关性,而人造黄油中ν(C=C)与δ(CH2)的峰面积比与碘值的相关性更高。Dyminska等[41]提出了一种方法,使用在1650 cm-1[ν(C=C)]和2850 cm-1[ν(CH2)]处观察到的红外和拉曼谱带的强度比确定食用油的碘值。红外光谱在1650和2850 cm-1处谱带的强度比与碘值的相关系数为0.988,拉曼光谱在1650和2850 cm-1处谱带的强度比与碘值的相关系数为0.976。这些结果可说明碘值与不饱和度之间具有极好的相关性,由于不同食用油的拉曼光谱差异非常小,这些方法同样可以用于橄榄油不饱和度以及碘值的测定。

3010 cm-1处的谱带强度可用来估计总顺式不饱和度[40]。Carmona等[25]使用拉曼光谱测定包括特级初榨橄榄油在内的12种植物油在3009～3013 cm-1[ν(C=C-H)]处的信号强度,每种油的不饱和度通过气相色谱法测定出的单不饱和酸的组合比例加上双不饱和酸比例的两倍和三不饱和酸的三倍计算,碘值通过Hanus方法实验确定。结果显示不饱和度及碘值与拉曼信号相对强度的曲线是一条相关系数非常高的曲线(R2>0.98)。这些结果证实了拉曼光谱是一种准确测定橄榄油不饱和度的工具。Barthus等[42]通过拉曼光谱所估计的碘值与AOCS认证的滴定方法所得到的碘值非常接近。拉曼光谱检测速度快且不需要使用其他试剂,可以作为一种快速有效检测橄榄油不饱和度的方法。

2.2 拉曼光谱法在橄榄油氧化稳定性方面的研究

油脂的氧化,不但会降低其品质,还会对食品安全和消费者的健康产生不利影响。氧化酸败是油脂败坏的主要原因之一。不饱和脂肪酸由于含有双键结构,容易被氧化,在氧化时可形成氢过氧化物(ROOH),氢过氧化物容易继续转化为共轭醛、酮、共轭二烯和三烯、饱和环氧化合物以及α,β-不饱和环氧化合物等物质,从而降低油的感官品质和营养质量[43]。过氧化值是衡量油脂酸败程度的指标之一,确定油脂过氧化值的方法主要包含两步,先将过氧化物与过量的碘离子反应,再使用硫代硫酸钠的标准溶液滴定得到的碘[26]。欧盟设定了特级初榨橄榄油最大耐受氧化程度的参数K232和K270,分别代表232和270 nm处的吸光度[26,43],232和270 nm处的吸光度值分别与共轭二烯和三烯的含量有关[44]。茴香胺值与油中醛、酮、醌等二级产物的含量密切相关,也是评估油脂氧化程度的重要参数[45]。

表2 拉曼光谱用于评估橄榄油的品质

由于振动光谱中含有大量的分子结构的信息,拉曼光谱可用于监测脂质氧化和评估橄榄油的氧化稳定性[46-49]。油受热分解后结构发生改变因而会改变其特征拉曼谱带。随着加热时间的增加,1640 cm-1处代表降解产物形成(主要是醛)的谱带强度逐渐增加;不饱和度和碘值在逐渐降低,主要表现在1267和3015 cm-1处的峰强度逐渐下降[44,47]。初榨橄榄油在1525 cm-1处的谱带是由类胡萝卜素等高度共轭化合物的C=C的伸缩振动引起的。类胡萝卜素被认为是初榨橄榄油中的特有成分,具有抗氧化的性质,随着橄榄油精炼过程的加剧而逐渐被破坏。El-Abassy等[40]使用拉曼光谱监测特级初榨橄榄油中类胡萝卜素在微波加热和传统工艺加热时的降解,结果显示:使用拉曼光谱预测的类胡萝卜素的含量与使用标准方法测量的实际值之间有完美的线性关系(R2=0.99),且加热时间越长,对橄榄油中的类胡萝卜素的损害越大。Muik等[44]研究了包括初榨橄榄油在内的六种食用油在160 ℃下加热9 h后的化学变化,加热90 min后类胡萝卜素所在峰(1525 cm-1)消失,表明这段时间是初榨橄榄油的稳定期。Muik等[44]发现拉曼光谱中1693 cm-1处的谱带强度与茴香胺值之间存在很高的相关性(R2=0.96),K270和1635 cm-1处的谱带强度之间也存在良好的相关性(R2=0.92),这也证明了1635 cm-1处的谱带与共轭三烯有关。由于所研究的六种油的拉曼光谱之间的最大差异是在1620、1680和1655 cm-1出现的C=C伸缩振动的差异,Muik等人使用1620和1680 cm-1之间的面积与1655 cm-1处谱带强度的比值(A1620-1680/I1655)来监测植物油的氧化,因为它能反映出油脂在氧化过程中含有共轭二烯和三烯以及异构化的化合物的形成。Guzman等[43]使用低分辨率拉曼光谱结合化学计量法评估橄榄油的氧化稳定性,结果表明:低分辨率拉曼光谱可以快速、无损、直接地确定橄榄油氧化状态的关键参数(如过氧化值、K232和K270),是评价橄榄油氧化状态的一种有效方法。

2.3 拉曼光谱检测橄榄油中其他成分并对其进行分类和鉴定

植物油中不皂化物含量的高低,可以表征油脂的纯度和掺杂情况,是鉴定油脂品质的指标之一。植物油的不皂化物含量约占0.2%～2%之间。目前,拉曼光谱已经可以用于橄榄油中不皂化物(如碳氢化合物、甾醇、萜烯醇、多酚)的检测。Baeten等[29]应用拉曼光谱结合化学计量学方法对角鲨烯、甾醇和萜烯醇等各种组分进行拉曼光谱鉴别。Paiva-Martins等[50]首先使用拉曼光谱结合密度泛函理论(DFT)对橄榄油中的羟基酪醇等酚类物质进行了表征和分析,证明了拉曼光谱是一种快速、无损鉴定酚类化合物的非常有前途的工具。

拉曼光谱还可用于测定橄榄油中的游离脂肪酸的含量[28,51]。El-Abassy等[28]使用拉曼光谱法结合多变量分析来确定特级初榨橄榄油中游离脂肪酸(FFA)的含量。对于不同的光谱区域建立了通过滴定获得的实际FFA%与基于拉曼光谱的预测值的校准曲线,在包含类胡萝卜素的945～1600 cm-1区域建立的回归曲线的斜率接近1,表明使用拉曼光谱的预测FFA值与使用滴定法的实际值之间的完美线性关系,同时也表明了FFA含量与类胡萝卜素有很强的相关性。

表3 拉曼光谱技术用于橄榄油的分类和鉴定

油橄榄的品质受到产地、品种和成熟度等多种因素的影响,橄榄油的感官和营养也会受到这些因素的影响。不饱和度、碘值、过氧化值、游离酸度等参数是影响橄榄油品质的重要因素,这些参数可以通过拉曼光谱进行预测并对橄榄油进行分类和鉴定。Gouvinhas等[19]利用短波长拉曼光谱结合主成分分析(PCA)、判别分析(DA)、主成分回归(PCR)和偏最小二乘回归(PLS-R)对不同成熟阶段的三个品种的橄榄所获得的橄榄油进行研究,评估和量化品种与其成熟度之间的统计学差异。结果显示:所研究的模型呈现出高的相关系数(R2>0.9333)。对于过氧化值的测定,PLS-R导致的测定误差低于PCR,而两种方法所获得的结果在游离酸度方面非常相似。拉曼光谱结合多元分析法可以用于监测特级初榨橄榄油中的游离酸度和过氧化值,以及区分成熟油和非成熟油。Marinas等[52]利用拉曼光谱结合偏最小二乘法(PLS)和判别分析对橄榄油进行定量和定性分析,PLS模型在收获年份、橄榄品种、地理起源和PDO方面分别得到了94.3%、84.0%、89.0%和86.6%的正确分类。利用拉曼光谱预测的多不饱和脂肪酸(PUFA),单不饱和脂肪酸(MUFA)和饱和脂肪酸(SFA)含量与实测值的误差都非常接近于0。

Muik等[51]利用傅里叶变换拉曼光谱结合PLS校准模型对橄榄油和橄榄中的游离脂肪酸含量进行预测,橄榄油的预测均方根误差(RMSEP)为0.29%,橄榄果实的预测均方根误差为0.28%。根据欧盟的规定,预测的游离脂肪酸含量用于不同类别的橄榄油和橄榄果实的分类。90%的油样和80%的橄榄果实被正确分类。这种方法非常简单便捷,可用于在线监测生产的橄榄油,并且这种方法可以在橄榄油加工前基于FFA含量对橄榄果实进行分类。此外,Muik等人[45]还利用傅里叶变换拉曼光谱和模式识别技术对橄榄果实的品质进行鉴别,这种测量方法能够直接作用于橄榄果实,因此可以根据橄榄果实的质量对其进行筛选,从而优化优质橄榄油的生产。

3 拉曼光谱用于橄榄油的掺伪鉴别

橄榄油因其感官品质和营养特性受到了大多数消费者的青睐,目前市面上橄榄油的掺假主要分为两种:一是优质橄榄油中掺入劣质橄榄油、橄榄果渣油;二是在橄榄油中掺入其它种类的油,如榛子油、玉米油、葵花籽油、地沟油等。拉曼光谱法具有快速、精确、灵敏度高的特点,目前已广泛应用于橄榄油的掺伪识别。通过拉曼光谱分析食用油中的成分及其含量可以定量或者定性鉴别劣质食用油[16]。由于不同植物油之间的光谱差异非常小,通常会结合主成分分析、聚类分析、判别分析、偏最小二乘法等化学计量法来对光谱数据进行统计分析。在这些方法中,主成分分析是通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构,即从原始变量中找出少数几个主成分,使其尽可能多地保留原始变量的信息,是一种区分光谱非常有力的工具,Zhang等[53]使用拉曼光谱以及主成分分析法准确地确定橄榄油中掺入5%或更多其他类型的油。通过拉曼光谱技术和化学计量法,可以实现初榨橄榄油与其他食用油的区分以及橄榄油的掺假检测和定量分析[54-63]。周秀军[24]提出了一种基于最小二乘支持向量机(LS-SVM)的拉曼光谱快速鉴别法。这种方法能实现最低掺杂量为5%左右橄榄油掺杂其他植物油的鉴别。Yang等[64]比较了拉曼光谱与近红外和中红外光谱在检测橄榄油和橄榄油混合物中的效率,虽然这三种技术都成功定量了特级初榨橄榄油中渣油的含量,但拉曼光谱的相关系数最高(R2=0.997),预测的标准误差最低(1.72%)。这些结果进一步证明了拉曼光谱在橄榄油掺杂鉴别中的潜力。类似的,Mendes等[61]通过近红外(NIR)、中红外(MIR)和拉曼光谱(Raman)技术分析橄榄油和大豆油的混合物以评估橄榄油的掺假,三种技术的均方根误差分别为1.76%(NIR),4.89%(MIR)和1.57%(Raman),测定系数R2均大于0.98,这种方法对橄榄油中大豆油的掺假检测是非常有效的,并且时间短,成本低,没有复杂的前处理程序。

表4 拉曼光谱技术用于橄榄油掺伪鉴别

拉曼光谱结合化学计量法虽然能够准确的实现对特级初榨橄榄油的掺伪鉴别,但是需要经过繁琐的数据处理并且需要专业的化学计量学知识,所以拉曼光谱在橄榄油掺伪鉴别方面的技术仍然需要改进。目前国内外已有直接通过拉曼谱图对橄榄油进行掺伪鉴别的研究,主要基于橄榄油的不饱和度和1525 cm-1处类胡萝卜素的含量对橄榄油是否掺伪进行研究。不饱和度可用于橄榄油的掺假检验,主要在2995～3050、1600～1700和1200～1400 cm-1这三个区域进行判断,如前所述,这三个区域的谱带强度与不饱和度之间的相关系数特别高,理论上最适合检测橄榄油的掺假。Carmona等[65]使用拉曼光谱所预测的不饱和度来区分澳洲坚果油、山核桃油、玉米油和葵花籽油,发现2995～3050、1600～1700和1200～1400 cm-1处的谱带强度与澳洲坚果油中添加玉米油或葵花籽油的比例呈极显著相关(R2>0.99),证明了拉曼光谱可以通过不饱和度对油脂的掺假进行检测,由于橄榄油的不饱和度较高,这种方法同样可以用于橄榄油的掺假鉴别。

橄榄油的拉曼光谱在1525 cm-1处的峰是由类胡萝卜素等高度共轭化合物的C=C的伸缩振动引起的。类胡萝卜素会在精炼的过程中消失,所以它们只存在于初榨橄榄油中,因此类胡萝卜素的含量可用于橄榄油的掺伪鉴别,掺入劣质油或果渣油会使橄榄油中类胡萝卜素的含量降低。张朝晖等[18]使用便携式拉曼光谱对80余份橄榄油样品和掺入不同质量分数果渣油的特级初榨橄榄油进行分析,发现75%的特级初榨橄榄油样品在1265 cm-1处的拉曼光谱强度低于540,而高于540的橄榄油可能存在等级造假,在特级初榨橄榄油中掺入果渣油,会使1265和1650 cm-1处的拉曼峰强度增加,1525 cm-1处的峰变小直至消失。与使用化学计量学的方法相比,谱图更加直观、方便且无需计算。Zou等[57]基于拉曼光谱振动带的强度比,特别是在1441 cm-1(-CH2-)处归一化的顺式=C-H和顺式-C=C-的强度比来检测橄榄油的掺伪,该方法能准确区分纯橄榄油与含有5%或更多其他食用油(如大豆油、菜籽油、玉米油等)的橄榄油。与传统的PCA方法相比,该方法更直观、精确、简单高效。

4 结论和展望

拉曼光谱基于特征峰强度与含量具有良好相关性且灵敏度高,通过拉曼光谱可预测橄榄油的不饱和度、碘值、过氧化值、游离酸度等参数,可对橄榄油的品质进行一系列的分析。拉曼光谱还可用于橄榄油的掺假鉴别,由于不同植物油之间的差异非常小,通常需要结合化学计量法才能进行判断,虽然结果准确,但却需要经过繁琐的数据处理和专业的化学计量学知识,基于橄榄油的不饱和度及类胡萝卜素的含量直接对其进行掺伪鉴别则更加简单、直观。拉曼光谱方法无需样品制备,仅在几秒钟内即可完成,适合现场使用,尤其是质量监管部门以及企业生产等领域的质量预测与控制。橄榄油的脂肪酸组成、特征风味物质及多酚类物质的含量会随着油橄榄的产地、生长环境、品种及成熟度等因素的变化而变化,可使用大量的样品建立光谱数据库,再结合化学计量法对光谱数据进行统计分析,从而对橄榄油进行分类鉴定。这些方法不仅可以用于橄榄油,还可用于橄榄果实的品质鉴定,在生产前对橄榄果实进行分类筛选,用以生产优质橄榄油。近几年仪器的发展和检测技术的提高解决了很多问题,如:傅里叶变换拉曼光谱技术可以消除荧光背景;显微拉曼光谱分析技术可以消除杂散光;便携式拉曼光谱可用于橄榄油的现场检测分析,更为方便。随着技术的发展,拉曼光谱在橄榄油中的应用也会越来越广泛。