外周血单个核细胞中CD69、CD40L表达在识别抗结核药物诱导超敏反应致敏药物中的价值

吴于青 姜国强 宗佩兰

江西省胸科医院结核科（南昌330006）

超敏反应是结核病患者在治疗过程中常见不良反应之一，约占抗结核药物不良反应的15%［1-3］；目前临床上对于抗结核药物超敏反应患者识别致敏药物主要依靠药物激发试验［4］，但有再次引起超敏反应甚至过敏性休克的可能，不仅延长患者住院时间，更有患者因此放弃治疗，不利于我国结核病的防控。由于抗结核药物是联合应用，如何快速、安全、准确的找出致敏药物是临床医师急需解决的难题。目前对于抗结核药物超敏反应诊断体外检测方法常用的有药物斑贴试验［5］和药物淋巴细胞转化实验（drug lymphocyte transformation test，DLTT），但敏感性都太低，甚至DLTT 被认为没有意义［6-7］。所以临床有必要采用其他的体外检测方法进行验证。由于抗结核药物超敏反应主要为迟发型超敏反应，由抗原特异性T 细胞介导，在致敏药物刺激后，药物特异性的T 淋巴细胞活化并在其表面表达多个活化标记，如CD25、CD69、CD71、CD40L 等，对这些活化标记的检测可以判断淋巴细胞的活化情况，从而识别出致敏药物。

本实验通过对抗结核药物超敏反应患者检测可疑药物刺激前后外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD69、CD40L 分子的表达变化，据此来识别可能的致敏药物，并将结果与药物激发试验比较，评价其在识别此类患者致敏药物中的敏感性与特异性，为临床寻找有价值的抗结核药物超敏反应体外检测方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 抗结核治疗过程中出现超敏反应的初治肺结核患者，根据临床表现及实验室检查符合药物超敏反应诊断［8-9］，并由2 名专科医师共同诊断。最终纳入26 例患者为病例组，男18 例，女8 例［1］，平均年龄（40.3 ± 4.6）岁，抗结核治疗方案均为2H（异烟肼）R（利福平）Z（吡嗪酰胺）E（乙胺丁醇）/4HR。对照组为10 例抗结核治疗2 个月未出现超敏反应的初治肺结核患者，男7 例，女3 例，平均年龄（39.2±5.7）岁。所有入选患者在治疗过程中除服用抗结核药物外未服用其他任何药物，未使用免疫抑制剂。本研究经江西省胸科医院伦理委员会批准，所有研究对象均签订知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 完全RPMI-1640培养基（含新生牛血清，双抗）（凯基生物，Cat：KGM31800S-500）；人外周血淋巴细胞分离液：（Solarbio，货号：P8900）；植物血球凝集素（PHA）（aladdin，Lot：C1418057）；异烟肼片（云鹏制药，国药准字：H14020769）；吡嗪酰胺胶囊（沈阳红旗制药有限公司；国药准字H20122352）；盐酸乙胺丁醇胶囊（沈阳红旗制药有限公司；国药准字H21021909）；利福平胶囊（上海延安药业有限公司；国药准字H31020036）；CD40L（BD Biosciences，555699）；CD69（BioLegend，310905）；快速瑞氏染液（KGA225，凯基生物）；CO2培养箱（BPN-80CWCUV，上皓庄仪器有限公司）；离心机（TD4A常州中提实验仪器）标准型双人单面超净工作台（SW-CJ-2FD）；三目倒置显微镜（XDZ-103，上海领成生物科技有限公司）；显微镜（CX41，OLYMPUS）；NovoCyteTM流式细胞仪（艾森生物（杭州）有限公司，NovoCyte 2060R）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验药物的制备 取患者所用可疑药物的单次剂量，用5 mL 双蒸水剧烈震荡溶解，再用0.22 μm 滤器过滤除菌，用RPMI 1640 培养液等比稀释。

1.3.2 PBMC 分离、细胞鉴定及培养 采用密度梯度离心法从患者肝素抗凝的血标本中分离外周血单个核细胞（PBMC），1×PBS 洗涤后，重悬于2 mL RPMI 1640 培养液（含10%胎牛血清+青链霉素）并计数，同时用快速瑞氏染色法对细胞鉴定后，调整细胞浓度至1 × 106/mL（部分用于检测药物刺激前PBMC中CD69、CD40L的表达）。在96孔板中，每孔加入1×105/100 μL，分别设置阴性对照孔（相同浓度的药物溶解介质50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL）、阳性对照孔（5 μg/mL 的PHA 50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL）、异烟肼孔（异烟肼50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL）、利福平孔（利福平50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL）、吡嗪酰胺孔（吡嗪酰胺50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL）和乙胺丁醇孔（乙胺丁醇50 μL+培养液50 μL+细胞100 μL），每组均设3 个复孔。将培养板置于37 ℃，5%CO2培养箱培养6 h，倒置显微镜下观察细胞生长状态。

1.3.3 流式细胞仪检测分析 离心获取细胞沉淀，然后重悬调整细胞浓度为每管1 × 106/mL，取细胞悬液100 μL，各加入2 种不同荧光标记抗体各20 μL（FITC 标记抗人CD40L 单抗+ FITC 标记抗人CD69 单抗），混匀，冰上避光孵育30 min；1 000 r/min 离心10 min，获取有核细胞，PBS 洗涤2 次后弃上清，加入1 mL PBS 将细胞悬浮，然后加入0.4 mL 1%多聚甲醛于4 ℃固定30 min，然后用流式细胞仪测试后分析结果。

1.4 药物激发试验 病例组患者在抗过敏治疗超敏反应消退后进行药物激发试验，找出致敏药物。

1.5 统计学方法 根据检测结果绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线），找出最佳的检测阈值。采用SPSS 13.0统计软件，用t检验比较组间差异，结果以（x ± s）表示。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞鉴定 如图1所示，单核细胞浆呈灰蓝色，胞浆中颗粒呈细小淡紫红色或蓝紫色。

图1 瑞氏染色细胞鉴定Fig.1 Rayleigh staining cell identification

2.2 患者PBMC 中CD40L 和CD69 的表达 在药物刺激孵育前，病例组和对照组两组患者的PBMCS中CD40L和CD69的表达差异无统计学意义（t=0.55，P＞0.05）。两组患者的PBMCs 分别与抗结核药物异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇共孵育6 h 后用流式细胞仪检测CD40L 和CD69 的表达，并根据后期药物激发试验结果将流式细胞检测结果分为致敏药物组和非致敏药物组；与对照组相比，致敏药物组患者PBMCs 中表达CD40L、CD69 的细胞比例明显升高（t=14.21，P＜0.05），而非致敏药物组PBMC 中表达CD40L、CD69 的细胞比例差异无统计学意义（t=1.53，P＞0.05），同时致敏药物组与非致敏药物组相比差异有统计学意义（t=15.24，P＜0.05）。见表1。

表1 患者PBMC 经可疑药物刺激6 h 后CD40L 与CD69 表达比较Tab.1 Comparison of CD40L and CD69 expression in patients with PBMC stimulated by suspicious drugs for 6 hours ±s，%

表1 患者PBMC 经可疑药物刺激6 h 后CD40L 与CD69 表达比较Tab.1 Comparison of CD40L and CD69 expression in patients with PBMC stimulated by suspicious drugs for 6 hours ±s，%

注：与非致敏药物组比较，*t=15.24，*P＜0.05

组别对照组致敏药物组非致敏药物组例数10 26 78（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）t 值P 值12.43±4.16 43.37±8.85*15.22±5.57 14.21 1.53＜0.05＞0.05

2.3 绘制ROC 曲线 根据检测结果通过SPSS 软件绘制ROC 曲线，判断Cut-off 值为35%时具有较好的敏感度和特异度。计算方法：灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）=73.08%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）=90.00%。见图2。

2.4 CD69、CD40L 检测在识别患者致敏药物的灵敏度与特异度 根据ROC 曲线结果，在抗结核药物刺激患者外周血单个核细胞后，当流式细胞仪检测的（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）细胞总数比例≥35%时，该方法检测致敏药物的灵敏度=73.08%，特异度=90.00%（表2）。图3可见1 例对照组患者的PBMCS 在4 种抗结核药物分别刺激后，表达的CD69+、CD40L+细胞比例均在35%以内；图4可见1 例抗结核药物超敏反应患者的PBMCS 在利福平胶囊刺激后，（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）细胞总数明显升高，后经药物激发试验证实为利福平过敏。

图2 CD69+/CD40L+T 细胞比例识别抗结核药物诱导超敏反应中致敏药物的ROC 曲线Fig.2 CD69/CD40L T cell ratio recognition of antituberculous drug induced hypersensitivity by ROC curve

表2 CD69、CD40L 分子检测对抗结核药物诱导超敏反应致敏药物识别的价值Tab.2 The value of CD69，CD40L molecular detection in the identification of antituberculotic drug induced hypersensitivity 例

3 讨论

图3 对照组在药物刺激后PBMC 细胞中两种抗体表达情况Fig.3 Expression of two antibodies in PBMC cells after drug stimulation in control group

图4 1 病例组患者在药物刺激后PBMC 细胞中两种抗体表达情况后经DPT 证实对利福平过敏Fig.4 In one case，the expression of two antibodies in PBMC cells after drug stimulation was confirmed by DPT as an allergy to rifampicin

抗结核药物导致的超敏反应主要表现为Ⅳ型（迟发型）超敏反应［10-11］，是由T 细胞介导；药物作为抗原或半抗原初次接触T 细胞后引起T 细胞活化，形成药物特异性T 细胞克隆长期存留于组织和血液中。当记忆性T 细胞再次接触致敏药物后便迅速活化，产生不同的炎症因子而引起各种临床表现。CD69 分子是T 淋巴细胞的早期活化标记，淋巴细胞在受到致敏药物的刺激并活化后，淋巴细胞表面CD69 表达明显增加，因此可用来评价个体细胞免疫应答的功能和是否对该刺激药物过敏［15］，说明通过检测该分子在药物诱导的迟发型超敏反应患者外周血淋巴细胞表面的表达变化的可用于迟发型超敏反应的诊断和识别致敏药物。研究表明，在机体的细胞免疫中，当抗原提呈细胞（APC）把抗原提呈给幼稚T 细胞并形成MHC-TCR复合物时，T 淋巴细胞表面的CD40L 分子表达上调，在复合物形成后的四小时内，T 细胞表面的CD40L 与抗原提呈细胞表面的CD40 结合，并刺激抗原提呈细胞产生协同刺激分子，在抗原和协同刺激信号的双重作用下，T 细胞被激活，成为针对此抗原的杀伤性T 细胞，产生相应的细胞因子和发挥效应功能［12-13］。流式细胞法已广泛用于T 细胞表面分子或细胞因子的检测［14］，因此，通过检测这些表面分子便可了解T 细胞的活化状态，从而帮助识别出致敏药物。

本研究运用流式细胞术检测抗结核药物超敏反应患者外周血PBMCs 中CD69 与CD40L 的表达，根据后期患者进行药物激发试验的结果对流式细胞结果进行分组，分为致敏药物组和非致敏药物组，发现经药物刺激后致敏药物组PBMCs中表达CD69+与CD40L+的细胞比例明显增高（43.37 ± 8.85）%，与对照组（12.43 ± 4.16）%、非致敏药物刺激组（15.22±5.57）%比较差异均存在统计学意义（P＜0.05），而对照组与非致敏药物刺激组患者比差异无统计学意义（P＞0.05），提示正常情况下药物特异性T 淋巴细胞处于静止状态，并没有明显的活化。而经过特异性抗原刺激后T 淋巴细胞活化，研究表明2 h 后即可检测到细胞膜表面CD69+与CD40L+表达上调，6～8 h 后达到高峰，所以本次实验中药物与PBMCs 孵育时间选择为6 h。根据ROC 曲线，在CD69+或CD40L+细胞比例的Cut-off 值为35%时，该检测识别致敏药物的敏感性为73.08%，特异性为90.00%，提示抗结核药物超敏反应患者外周血单个核细胞经可疑的致敏药物刺激后，通过检测CD69+、CD40L+水平对识别此类患者的致敏药物有一定的临床价值，并且敏感性较DLTT 明显升高，考虑DLTT 敏感性低的原因在于：在PBMCs 中，即使有药物特异性的T 细胞出现，DLTT 的T 细胞并不足以被检测到细胞分裂，所以会产生假阴性的结果，而T 细胞在抗原刺激活化后，表面形貌产生变化，增高增大，细胞表面的CD40L、CD69 等分子表达短时间内迅速增加聚集，因此将其作为T 细胞活化表征来作为检测标记敏感性高且更有诊断价值。但因本次研究样本量较少，同时药物与T 细胞共刺激的时间选择多长，检测的敏感性才最高有待于扩大样本量进一步研究验证。

总之，药物超敏反应的体外检测方法种类繁多，不同的体外检测方法对不同种类药物的敏感性及特异性均不相同，对于抗结核药物诱导的超敏反应致敏药物的识别哪些体外检测方法最佳有待于进一步研究。